医学论文论甘油磷酸胆碱的层析纯化及其稳定性研究

　　甘油磷酸胆碱(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha．GPC)是脂磷脂酰胆碱(PC)分子上的两个脂肪酰基完全被水解掉的产物。药物代谢动力学表明：PC被吸收进入血液循环，分布在各器官，它也是人体内分泌代谢的水溶性小分子物质，能通过血脑屏障，为重要的神经传递质乙酰胆碱(Acetyl—choline)的生物合成前体。根据“胆碱能损伤假说”，老年痴呆症的发病机制(记忆力、认知障碍等)与神经递质乙酰胆碱水平降低密切相关，如果提高脑内乙酰胆碱水平，可以显著改善老年痴呆患者认识功能损伤的症状。有专利报道了甘油磷酸胆碱和茴拉西坦同时服用，可以治疗阿尔茨海默氏症。临床研究表明：GPC治疗脑缺血性中风、阿尔茨海默氏症、多发性脑梗死型痴呆疗效显著。临床用于改善中毒性肝损伤等保肝作用 ；同时，GPC还具有显著的防衰老、降血脂、健脑等多种功效，作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视。GPC已经在意大利、波兰、韩国、俄罗斯、希腊、智利、巴西等国家上市，可在我国，还处于研发阶段。本试验，采用三氧化二铝脱色法 和硅胶柱层析法 相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行分离纯化，并采用高效液相色谱法对其在强光照射、高温、高湿等条件下的稳定性进行研究，从而为其生产、包装、贮存、制剂研发等提供科学依据。

　　1 仪器与试药

　　1．1 主要仪器上海民桥精密科学仪器有限公司SL202N型电子天平；长沙湘仪离心机有限公司TGI6一WS台式高速离心机；江苏金坛晶玻实验仪器厂HH一2型恒温水浴锅；美国ALLTECH2000蒸发光散射检测器，配备单岛津液相LC一10ATVP输液泵，六通阀手动进样，浙江大学N2000色谱工作站。

　　1．2 主要试药GPC粗品由合肥工业大学医学工程学院实验室酶法生产；GPC对照品从意大利Euti．cals S．pA公司购买；GPC产品(批号为100301，100302，100303)由本实验室分离纯化制得。无水乙醇、甲醇、二氯甲烷均为天津四友公司生产的分析纯试剂，乙腈为天津四友公司生产的色谱纯试剂，所用水为超纯水机制备的去离子水；三氧化二铝和硅胶粉均为100—200目，由国药集团生产。

　　2 方法与结果

　　2．1 甘油磷酸胆碱的层析纯化

　　2．1．1 三氧化二铝和硅胶粉的预处理 三氧化二铝的预处理：将三氧化二铝平铺在容器中，于25O℃的烘箱中烘烤4 h待用；硅胶粉的预处理：将硅胶粉平铺在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

　　2．1．2 三氧化二铝对甘油磷酸胆碱粗品脱色 选择甘油磷酸胆碱与三氧化二铝的质量比为1：10。

　　在烧杯中称取实验室制备的甘油磷酸胆碱约10 g，加入无水乙醇约100 mL，置于50℃的恒温水浴锅中保温，搅拌，使得甘油磷酸胆碱完全溶解后，加入约100 g经过预处理的三氧化二铝，搅拌脱色2 h，离心分离，除去下层三氧化二铝。将上层溶液蒸发浓缩除去溶剂，得到塑黄色的甘油磷酸胆碱4．2 g。

　　2．1．3 硅胶柱层析法进一步纯化甘油磷酸胆碱称取约210 g经过预处理的硅胶粉，用甲醇溶胀24h后，湿法装柱。将经过三氧化二铝脱色的4．2 g甘油磷酸胆碱产品溶于少量乙醇中，小心的加入层析柱内。缓慢的加入洗脱剂(甲醇：乙醇：氯仿=60：35：15)进行洗脱，分段收集柱下端流出的洗脱液，检测，合并含有甘油磷酸胆碱的洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，得到甘油磷酸胆碱产品。

　　2．2 甘油磷酸胆碱的含量测定及稳定性研究

　　2．2．1 对照品溶液的制备精密称取意大利Euti．cals S．pA公司的GPC对照品适量，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中定容，得到约10 g·L的储备液，冰箱保存备用。

　　2．2．2 色谱条件浙江大学N2000工作站，色谱柱为GraceSmart RP 8柱(250 mm×4．6 Bin，5I,zm)，流动相为60％ 乙腈一水溶液，流速为0．7mL·min～，柱温为(25-4-1)qC。检测器为美国All—tech 2000型蒸发光散射检测器，漂移管温度为109％ ，载气为空气，气体流速为3．5 mL·min，进样量为20 L。

　　2．2．3 标准曲线的测定分别精密吸取GPC对照品储备液1、2、3、5、10、20 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容后，摇匀。精密量取20 L进样，记录色谱峰面积。对进样浓度(mg·L )和峰面积分别取对数，然后以浓度的对数lnC对甘油磷酸胆碱峰面积的对数y进行线性回归，求得标准曲线方程为：Y=0．538 1lnC一8．722，R =0．999，线性范围为100—2 000 mg·L～。实验结果见图1。

　　通过图1可以看出，硅胶柱层析后GPC在图谱上表现为单峰。无论是从外观上还是从HPLC谱图上分析，都可以得出结论：通过硅胶柱层析能够得到GPC纯品。

　　2．2．4 样品含量测定方法 精密称取经过分离纯化的GPC适量，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中定容，得到约10 g·L 的溶液。精密量取该溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀。精密量取20 L进样，记录色谱峰面积，并采用外标两点对数法计算样品含量。

　　2．2．5 回收率试验分别精密吸取对照品储备液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容后，摇匀，作为对照品溶液。精密称取分离纯化的GPC(批号100301)适量，用流动相溶解，分别制成约含GPC 0．4、0．5、0．6 g·L 的溶液各3份。精密量取20 L进样，记录色谱峰面积。采用外标两点对数法计算含量，并求得回收率。

　　平均回收率为99．81％ ；RSD=0．85％(n=9)。

　　2．2．6 精密度试验对照品溶液取“2．2．5”项下的对照品溶液。精密称取分离纯化的GPC产品(批号100301)适量，用流动相溶解，制成约含GPC 0．5g·L 的溶液。精密量取20 L进样，进样6次，记录色谱峰面积。采用外标两点对数法计算样品含量，并计算相对标准偏差。结果测得GPC的含量分另0为：99．02％ 、99．67％ 、100．14％ 、100．18％ 、99．28％ 、99．95％ ，平均含量为99．7l％ ，RSD =0．48％ (n=6)。

　　2．2．7 强光照射试验 取分离纯化的GPC(批号100301)3份，编号为100301—1、100301—2、100301—3，分别平铺在培养皿中，使其厚度≤5mm，置于澄明度测定仪下(光线强度为4 500 LX)10 d，于第5、10天取样，与第0天的含量比较，考察其含量变化。平均含量为99．51％；RSD=0．40％(凡=9)，结果表明含量无明显变化，即GPC对光比较稳定。