食品中苯巴比妥快速检测方法的研究

发布时间：2017-06-08 19:01

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【摘要】：苯巴比妥是一类精神药品,常用于镇静和催眠。由于利益驱使,一些不法分子将其非法添加在助眠类保健食品中,长期食用后,苯巴比妥会在体内蓄积,对人体健康造成威胁。因此,亟需开发简便、快速、高灵敏度的苯巴比妥检测方法。本论文在此领域开展了以下研究:人工合成苯巴比妥完全抗原并进行鉴定。对苯巴比妥结构进行修饰,合成含有氨基和羧基的苯巴比妥半抗原,经重氮法和碳二亚胺法与BSA和OVA制备苯巴比妥人工抗原。通过TLC、质谱、核磁对苯巴比妥半抗原进行鉴定,并采用紫外扫描对人工抗原进行结构鉴定,通过动物免疫对人工抗原进行生物学鉴定,使用ELISA对得到的抗血清进行鉴定分析。结果表明:苯巴比妥半抗原已成功合成,苯巴比妥与BSA、OVA偶联成功,PAPB-BSA偶联比为23.20:1,PCPB-BSA偶联比为15.44:1,PAPB-OVA偶联比为10.91:1。动物免疫表明,免疫的10只小鼠的效价均在103以上,且5号小鼠的抗血清抗苯巴比妥IC50为95.49 ng/mL。本实验成功合成了苯巴比妥人工抗原,为进一步制备苯巴比妥的特异性抗体与建立苯巴比妥免疫学检测方法奠定了基础。用合成的两种人工抗原免疫BALB/C小鼠用以制备抗苯巴比妥单克隆抗体,三免后小鼠血清效价可达104,用PEG进行细胞融合,共获得4株可稳定分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,并用BCA试剂盒测定其蛋白浓度。获得的抗体进行免疫特性分析,抗体亲和常数为4.13×108 L/mol,IC50为10.76 ng/mL,抗体效价达到了105以上。该抗体除与苯巴比妥钠交叉反应率为87.84%外,与其他苯巴比妥结构类似物无交叉反应。胶体金免疫层析技术因为具有简便快捷、准确直观等优点而成为目前现场实时应用最广泛的一种诊断方法,与单克隆抗体技术的结合又使其具有良好的特异性和敏感性。本实验利用胶体金标记的抗苯巴比妥单克隆抗体为探针制备了检测苯巴比妥的胶体金免疫层析试纸条。利用柠檬酸三钠还原法制备粒径约为33 nm的胶体金。在标记苯巴比妥单克隆抗体时,最佳pH值在7左右,最适标记抗体浓度为18μg/mL。经试验确定了NC膜抗原最佳包被浓度为1.5 mg/mL,驴抗鼠二抗最佳包被浓度为0.75 mg/mL,同时两者按照0.75μL/cm喷膜。用组装好的试纸条检测苯巴比妥标准溶液,检测限30 ng/mL。检测添加苯巴比妥的保健食品原料水提取样本时,检测限为30 ng/mL。交叉反应实验说明所制备的试纸条与巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥无交叉反应。在室温干燥条件下试纸条可以保存3个月以上,在不同批次和同一批次内有良好的重复性。本实验制备的试纸条方便、快捷,在15 min内就可以直观的判断检测结果,适用于现场实时检测。
【关键词】：苯巴比妥 人工抗原 单克隆抗体 胶体金 免疫层析试纸条
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略语表7-12
• 第1章 绪论12-24
• 1.1 引言12-13
• 1.2 苯巴比妥13-16
• 1.2.1 理化性质13-14
• 1.2.2 临床应用14-15
• 1.2.3 苯巴比妥的代谢15
• 1.2.4 毒性作用15-16
• 1.3 现有的苯巴比妥检测方法16-18
• 1.3.1 高效液相色谱法（HPLC）16-17
• 1.3.2 反相高效液相色谱法（RP17
• 1.3.3 液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）17
• 1.3.4 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）17
• 1.3.5 毛细管电泳法17-18
• 1.3.6 荧光分析法18
• 1.3.7 其它方法18
• 1.4 胶体金免疫层析技术18-21
• 1.4.1 胶体金18-19
• 1.4.2 免疫胶体金的制备19
• 1.4.3 胶体金免疫层析技术的原理19-20
• 1.4.4 胶体金免疫分析法的优点20-21
• 1.5 胶体金免疫层析技术在快速检测中的应用21-22
• 1.5.1 在食品药物残留快速检测中的应用21
• 1.5.2 在致病微生物检测中的应用21
• 1.5.3 在真菌毒素检测中的应用21-22
• 1.5.4 在重金属检测中的应用22
• 1.5.5 在疾病监测中的应用22
• 1.6 研究目的与意义22-24
• 第2章 苯巴比妥人工抗原合成及鉴定24-40
• 2.1 材料与仪器25-26
• 2.1.1 主要试剂25
• 2.1.2 主要仪器25
• 2.1.3 实验动物25
• 2.1.4 主要溶液的配制25-26
• 2.2 实验方法26-29
• 2.2.1 苯巴比妥半抗原的合成26-27
• 2.2.2 苯巴比妥人工抗原合成27
• 2.2.3 人工抗原紫外光谱扫描鉴定27-28
• 2.2.4 动物免疫28
• 2.2.5 间接ELISA分析小鼠抗血清效价28
• 2.2.6 间接竞争ELISA分析小鼠抗血清特异性28-29
• 2.3 结果与分析29-38
• 2.3.1 苯巴比妥半抗原TLC监测结果29-31
• 2.3.2 苯巴比妥半抗原质谱鉴定结果分析31-33
• 2.3.3 苯巴比妥半抗原核磁鉴定结果33-34
• 2.3.4 人工抗原紫外扫描结果34-36
• 2.3.5 间接ELISA测定小鼠抗血清效价结果36-37
• 2.3.6 间接竞争ELISA分析小鼠抗血清特异性结果37-38
• 2.4 讨论38-40
• 第3章 苯巴比妥单克隆抗体制备与鉴定40-59
• 3.1 材料与仪器40-42
• 3.1.1 主要试剂40
• 3.1.2 主要仪器40
• 3.1.3 实验动物和细胞40
• 3.1.4 主要溶液40-42
• 3.2 实验方法42-50
• 3.2.1 小鼠免疫42-43
• 3.2.2 小鼠效价和抑制水平的测定43
• 3.2.3 杂交瘤细胞株的建立43-47
• 3.2.4 苯巴比妥单克隆抗体的生产47-48
• 3.2.5 苯巴比妥单克隆抗体特性鉴定48-50
• 3.3 结果与分析50-57
• 3.3.1 免疫小鼠抗血清的筛选和鉴定结果50-51
• 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立51-52
• 3.3.3 苯巴比妥单克隆抗体特性鉴定结果52-57
• 3.4 讨论57-59
• 第4章 苯巴比妥胶体金试纸条的研制59-81
• 4.1 材料与仪器59-60
• 4.1.1 主要试剂59
• 4.1.2 主要仪器59
• 4.1.4 主要溶液59-60
• 4.2 实验方法60-66
• 4.2.1 胶体金的制备60
• 4.2.2 胶体金的鉴定60-61
• 4.2.3 胶体金标记抗体蛋白最佳条件的确定61-62
• 4.2.4 金标抗体的制备与纯化62-63
• 4.2.5 金标抗体活性的鉴定63
• 4.2.6 试纸条制备条件的优化63-64
• 4.2.7 试纸条的组装与测试64-65
• 4.2.8 苯巴比妥胶体金试纸条性能测试65-66
• 4.3 结果与分析66-79
• 4.3.1 胶体金质量鉴定66-68
• 4.3.2 胶体金标记抗体蛋白最佳条件优化结果68-71
• 4.3.3 金标抗体活性鉴定结果71-72
• 4.3.4 试纸条制备条件优化结果72-74
• 4.3.5 试纸条测试结果74-76
• 4.3.6 苯巴比妥胶体金试纸条性能测试结果76-79
• 4.4 讨论79-81
• 第5章 结论与展望81-83
• 5.1 结论81-82
• 5.2 展望82
• 5.3 创新点82-83
• 致谢83-84
• 参考文献84-89
• 附录1 主要试剂89-91
• 附录2 主要仪器设备91-92
• 个人介绍92
• 攻读学位期间的研究成果92

【参考文献】

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本文编号：433417