胞内钙重分布在铅所诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-07-04 21:14

  本文关键词：胞内钙重分布在铅所诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用

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【摘要】：铅是环境中一种常见的污染物,能够通过多种方式进入机体并对机体造成损伤;铅对机体的损伤呈多系统性和多器官性。其中,肾脏是铅毒性损伤的重要靶器官之一,而肾小管是铅肾毒性损伤的靶部位。前期研究表明,氧化应激所诱导的细胞凋亡在铅染毒所致原代大鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中发挥主导作用;同时,铅诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡过程中伴随胞浆钙超载。作为重要的凋亡信号,胞浆钙受制于线粒体与内质网的调控;二者均为重要的胞内钙库,在胞内钙稳态调控中发挥重要作用。因此,铅诱导大鼠肾小管上皮细胞胞浆钙水平升高的来源及胞内钙重分布对凋亡的影响有待于研究。本研究以原代培养的大鼠肾小管上皮细胞为体外染毒模型,采用胞浆Ca2+特异性探针Fluo-4-AM,线粒体Ca2+特异性探针dihydro-Rhod-2-AM和内质网Ca2+特异性探针Mag-Fluo-4-AM结合共聚焦显微技术分别检测铅暴露对胞浆、线粒体和内质网不同区域Ca2+水平的影响。其次,肾小管细胞分别经含钙和无钙两种培养体系进行不同时间(0,1,2 h)铅暴露,采用流式细胞术检测其对胞浆钙水平的影响。细胞经胞浆钙螯合剂BAPTA-AM预孵育30 min,进行铅染毒,检测胞浆钙与线粒体钙水平的变化。细胞进行铅与内质网钙释放通道受体(IP3R)特异性抑制剂2-APB共孵育12 h,检测其对铅所诱导胞内钙重分布的影响。同时,采用放射免疫分析法、免疫印迹分析法和定量PCR法分别检测铅染毒对IP3含量、IP3R两种亚型IP3R-1与IP3R-2蛋白表达及基因转录水平的影响。最后,分别检测BAPTA-AM与2-APB对铅所诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响。结果表明:在铅暴露过程中,胞浆钙超载主要来源于细胞内;胞浆钙超载伴随线粒体钙超载和内质网钙水平降低,而2-APB可显著改变铅所致的这种胞内不同区域钙分布。BAPTA-AM仅一定程度缓解铅所诱导的线粒体钙水平升高,表明线粒体钙超载主要来源于内质网。铅染毒导致肾小管上皮细胞胞内IP3含量升高,IP3R-1与IP3R-2基因转录和蛋白表达量均显著升高。此外,2-APB和BAPTA-AM均可显著抑制铅诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡。总之,在铅暴露过程中,IP3-IP3R介导的内质网钙释放是大鼠肾小管上皮细胞胞浆钙超载与线粒体钙超载的主要原因;胞内钙重分布参与调控细胞凋亡,而内质网钙释放在这其中发挥主导作用。
【关键词】：铅 细胞凋亡 细胞内钙分布 肾小管上皮细胞
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要10-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-22
• 1.1 铅的污染状况及毒性研究进展13-14
• 1.1.1 铅的理化性质13
• 1.1.2 铅的污染状况13-14
• 1.1.3 铅的肾毒性研究进展14
• 1.2 细胞凋亡研究进展14-17
• 1.2.1 死亡受体通路15
• 1.2.2 线粒体通路15-16
• 1.2.3 内质网通路16-17
• 1.3 钙离子信号与细胞凋亡17-22
• 1.3.1 胞内钙离子正常分布状况18
• 1.3.2 胞内钙稳态的维持18-20
• 1.3.3 钙稳态失衡与细胞凋亡20-22
• 2 材料与方法22-37
• 2.1 实验动物22
• 2.2 主要试剂22-23
• 2.3 主要仪器23-24
• 2.4 实验所用溶液的配制24-27
• 2.4.1 磷酸盐缓冲液的配制24
• 2.4.2 含钙及无钙DMEM-F12细胞培养基的配制与除菌24-25
• 2.4.3 醋酸铅溶液的配制25
• 2.4.4 2-APB的配制25
• 2.4.5 BAPTA-AM的配制25
• 2.4.6 10 × Western Blot蛋白质电泳缓冲液的配制25
• 2.4.7 10 × Western Blot蛋白质电转印缓冲液的配制25
• 2.4.8 30 %丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(Acr/Bic)的配制25-26
• 2.4.9 10%SDS溶液的配制26
• 2.4.10 10%过硫酸铵(APS)溶液的配制26
• 2.4.11 10 × TBS溶液的配制26
• 2.4.12 1 × TBST工作液的配制26
• 2.4.13 5 % Western Blot封闭缓冲液的配制26
• 2.4.14 鼠尾胶原的制备26-27
• 2.4.15 HCl和NaOH溶液配制27
• 2.5 试验方法27-37
• 2.5.1 SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养及传代培养27
• 2.5.2 试验分组27
• 2.5.3 流式细胞仪检测细胞凋亡27-28
• 2.5.4 胞浆钙离子浓度的检测28-29
• 2.5.5 线粒体钙离子浓度的检测29-30
• 2.5.6 内质网钙离子浓度的检测30-31
• 2.5.7 IP_3含量的检测31
• 2.5.8 蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)31-33
• 2.5.9 荧光定量PCR33-36
• 2.5.10 统计学分析36-37
• 3 结果与分析37-59
• 3.1 铅诱导大鼠肾小管上皮细胞胞浆钙超载37-40
• 3.2 铅暴露诱导大鼠肾小管上皮细胞不同区域钙分布紊乱40-42
• 3.3 铅暴露对大鼠肾小管上皮细胞线粒体钙及内质网钙水平的影响42-45
• 3.4 铅诱导线粒体钙超载的来源45-49
• 3.5 2-APB对铅暴露所诱导胞内钙分布紊乱的影响49-53
• 3.6 铅暴露对大鼠肾小管上皮细胞内IP_3含量的影响53-54
• 3.7 铅暴露对胞内IP_3R-1 和IP_3R-2 mRNA和蛋白表达水平的影响54-57
• 3.7.1 铅暴露对IP_3R-1 和IP_3R-2 的mRNA表达水平的影响54-55
• 3.7.2 铅暴露对IP_3R-1 和IP_3R-2 蛋白表达水平的影响55-57
• 3.8 2-APB或BAPTA-AM对铅所诱导细胞凋亡的影响57-59
• 4 讨论59-64
• 4.1 铅暴露诱导大鼠肾小管上皮细胞钙分布紊乱59-60
• 4.2 内质网与钙分布紊乱60-61
• 4.3 IP_3R通道介导的内质网钙释放61-62
• 4.4 钙分布紊乱与细胞凋亡62-64
• 5 结论64-65
• 参考文献65-74
• 致谢74

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