三氯乙烯对人正常肝细胞亚细胞蛋白质组影响的研究

发布时间：2017-08-01 18:02

  本文关键词：三氯乙烯对人正常肝细胞亚细胞蛋白质组影响的研究

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【摘要】：目的: 观察三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)对人正常肝细胞(L-02细胞)亚细胞蛋白质组的影响,探讨其潜在肝毒性作用机制。方法： (1)细胞增殖水平的测定及膜蛋白富集的验证。采用CCK-8的方法建立TCE致L-02肝细胞剂量-反应关系,通过SPSS软件计算其半数抑制浓度(IC50)。在IC50确定的基础上,以IC50值倍减的浓度梯度进行TCE染毒,进行细胞增殖实验,以测定细胞的增殖活性。利用Proteo ExtractTM subcellular proteome extraction kit试剂盒提取膜蛋白组分、核蛋白组分和胞浆蛋白组分。以Na+/K+-ATPase作为膜蛋白的标志物,通过Western Blot分析膜蛋白组分和胞浆蛋白组分中Na+/K+-ATPase的表达水平,总蛋白组分作为对照组进行膜蛋白富集的验证。以Lamin B1作为核蛋白的标志物,同样通过Western Blot分析其表达水平,总蛋白做对照。(2)2D-DIGE(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis)结合MALDI-TOF/TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)技术分析筛选并鉴定差异表达亚细胞蛋白。具体方法是2.0 mmol/L和8.0 mmol/L TCE处理L-02细胞后提取膜蛋白组分和核蛋白组分,未经TCE处理的L-02细胞所提取的膜蛋白组分作为对照组,共分成4批细胞提取。提取的膜蛋白组分经过准确定量后,进行荧光标记和双向电泳。获得的图像经过扫描后使用De Cyder software package进行分析,寻找到差异表达的蛋白点后进行普通双向考染,接着对考染的胶进行挖胶酶解,最后获得的样品进行MALDI-TOF/TOF-MS鉴定分析,核蛋白组分也按照上述方法进行处理分析。(3)生物信息学分析。通过在线分析软件TMpred program对鉴定出来的膜蛋白组成差异蛋白进行跨膜结构域(transmembrane domain)的预测。STRING数据库构建L-02细胞经过TCE处理与未经过TCE处理差异表达的膜蛋白及核蛋白的相互作用网络。利用DAVID数据库对差异蛋白进行生物过程富集分析。(4)TCE染毒L-02细胞后差异表达亚细胞蛋白的验证。分别以0mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、8.0 mmol/L剂量的TCE染毒L-02肝细胞,24 h后,用Western Blot去检测差异表达膜蛋白和核蛋白,验证前期亚细胞蛋白质组学筛选鉴定结果的可靠性。结果： (1)TCE染毒L-02细胞24 h后的半数抑制浓度为16.0 mmol/L。采用1/2的IC50为最大染毒剂量,发现2.0 mmol/L,4.0 mmol/L,8.0 mmol/L TCE染毒组与对照组(0 mmol/L)相比均具有显著性差异,TCE对细胞的增殖活性产生影响显著。Na+/K+-ATPase在膜蛋白组分中的表达水平显著高于在全蛋白组分和胞浆蛋白组分(全蛋白质、胞浆蛋白和膜蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.10、0.12±0.01和1.5±0.16,P0.01)。Lamin B1在核蛋白组分的表达水平显著高于全蛋白和胞浆蛋白组分(全蛋白质、胞浆蛋白和核蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.05、0.08±0.01和2.3±0.28,P0.01)。这些结果表明膜蛋白质和核蛋白质均在各自组分得到良好的富集,可用于后续分析。(2)利用2D-DIGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法共鉴定出15个差异蛋白。通过TMpred数据库分析,发现在膜蛋白组分的15个差异蛋白中,有10个具有1个以上的跨膜结构域,说明这10个蛋白为膜蛋白。另外4个蛋白没有跨膜区,但它们的亚细胞定位与细胞膜相关。而在核蛋白组分的24个差异蛋白中,有22蛋白的亚细胞定位与细胞核相关。DAVID富集分析表明差异表达蛋白主要与RNA过程相关,尤其在RNA剪接这一生物学过程出现明显的聚集。通过STRING分析,膜蛋白功能富集较松散,核蛋白功能富集较紧密。(3)不同浓度TCE处理前后膜蛋白ATP合成酶β亚基(ATP5B)、蛋白二硫键异构酶(P4HB)、核蛋白核不均一性核糖核蛋白H2(HNRNPH2)和上游识别序列结合蛋白(FUBP1)的表达水平。所有验证的蛋白变化趋势与蛋白质组学结果一致(P0.05或P0.01)。结论： (1)本研究应用一种提取亚细胞器的方法,该方法能有效地富集L-02细胞的膜蛋白和核蛋白组分,2D-DIGE结合MALDI-TOF/TOF-MS技术可实现差异亚细胞蛋白的鉴定分析,为外源性化合物致细胞的亚细胞蛋白质组学研究提供了新思路和新方法。(2)TCE染毒可以引起L-02肝细胞中膜蛋白质组表达水平的改变,这些差异蛋白在细胞死亡调节、细胞凋亡调节及细胞稳态出现聚集,相互作用分析显示功能富集比较松散。Western Blot结果显示ATP5B和P4HB的变化水平和蛋白质组学结果一致。(3)TCE染毒可以引起L-02细胞核蛋白质组表达水平的改变,这些差异蛋白主要在RNA剪切过程中出现聚集,相互作用分析显示功能富集比较密集。Western Blot结果显示HNRNPH2和FUBP1的变化水平和蛋白质组学结果一致。
【关键词】：三氯乙烯(TCE) 人正常肝细胞(L-02细胞) 亚细胞蛋白质 膜蛋白质 核蛋白质
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 前言11-23
• 1 三氯乙烯毒理学研究11-13
• 2 亚细胞蛋白质组学最新进展13-16
• 3 本课题已有研究基础16-17
• 4 课题研究目的及实验方案17-23
• 第二章 细胞增殖的测定及亚细胞蛋白富集的验证23-36
• 1 引言23
• 2 实验材料23-28
• 3 实验方法28-32
• 4 结果32-35
• 5 讨论35
• 6 本章小结35-36
• 第三章TCE对L-02 细胞膜蛋白质组的影响36-56
• 1 引言36
• 2 实验材料36-37
• 3 实验方法37-42
• 4 结果42-54
• 5 讨论54-55
• 6 本章小结55-56
• 第四章TCE对L-02 细胞核蛋白质组的影响56-77
• 1 引言56
• 2 实验材料56-57
• 3 实验方法57-58
• 4 结果58-75
• 5 讨论75-76
• 6 本章小结76-77
• 第五章 差异表达蛋白的验证77-85
• 1 引言77-78
• 2 实验材料78
• 3 实验方法78-79
• 4 结果79-82
• 5 讨论82-83
• 6 本章小结83-85
• 结论85-87
• 展望87-89
• 参考文献89-98
• 附录98-100
• 英文缩略词表98-99
• 攻硕期间发表论文99-100
• 致谢100

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：605469