香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传改变研究

发布时间：2017-08-10 21:07

  本文关键词：香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传改变研究

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【摘要】：目的：对永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)进行体外香烟烟雾染毒,建立细胞体外染毒恶性转化模型,观察BEAS-2B细胞在恶性转化过程中相关抑癌基因的启动子甲基化情况和mRNA表达情况以及相关甲基化转移酶的表达情况,探究香烟烟雾致肺癌的发生机制,为筛选香烟烟雾致肺癌的早期分子标志物提供理论依据。 方法：采用永生化的人支气管上皮细胞株(BEAS-2B细胞)进行体外染烟,在BEAS-2B细胞生长至对数生长期时,以5×104每皿的量接种于Transwell膜培养皿中培养,次日将Transwell膜培养皿置于细胞气体染毒装置进行香烟烟雾染毒,染毒装置的氧气浓度恒定在21%,水浴维持染毒腔温度为37-C,结合文献以及CCK--8结果确定合适的香烟烟雾染毒浓度以及染毒时间。细胞连续染毒两次作为染毒一代,共染毒30代,传代40代。分别检测对照组和染毒代1代、10代、20代、30代细胞及各自传代40代后其周期和凋亡率,ROS水平以及软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验等细胞恶性转化的指标。用Q-PCR技术检测各组细胞中甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况。用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测对照组细胞以及Sm20-40和Sm30-40中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、 FHIT以及重复序列LINE-1基因的甲基化状况并检测RASSF1A、p16和FHIT基因的表达水平。 结果：(1)CCK.-8结果：CCK-8数据显示随着染烟浓度以及时间增加,细胞增殖抑制率也在不断上升,最终我们选择的染烟浓度为20%,染烟时间是10分钟,在此条件下,细胞染烟后增殖抑制率在30%左右。(2)基础指标检测：各染毒组细胞G1期比例均有所降低(P0.05),S期细胞比例均有所上升(P0.05)。细胞第一次染毒后凋亡率明显升高(P0.05),但在染毒后期传代的细胞凋亡率明显降低,从Sm20-40到Sm30-40,与对照组相比具有统计学意义。各染毒组细胞与对照组相比,ROS水平均出现上升趋势,且随着染毒代数增加,出现剂量效应关系。(3)细胞恶性转化程度：细胞软琼脂克隆形成实验结果显示,BEAS-2B细胞在软琼脂中有较小的克隆形成率,在10%左右,但随着细胞染毒代数的增加以及传代,软琼脂克隆形成率逐渐增高,染毒30代克隆形成率最高,可达50%以上(P0.05)。裸鼠成瘤实验表明染毒30代并传代40代的BEAS-2B细胞已具有体外裸鼠成瘤能力,Sm30-40细胞裸鼠成瘤率达到40%。分离瘤体做病理分析可见瘤细胞大小不一,呈弥漫性分布,异型性,为低分化癌,对照组裸鼠瘤体病理分析未见异型性明显的细胞。(4)基因表达以及甲基化状况：染毒并传代组细胞出现了DNMT1表达量下降的情况(P0.05)；而相反的,染毒组细胞相对于对照组,DNMT3a表达量有不同程度的升高(P0.05),到染毒后期最高,呈现出剂量效应关系。对RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因启动子特异位点的甲基化状况检测结果发现：对照组细胞RASSF1A、FHIT基因没有甲基化的表达,而染毒组细胞出现高甲基化状态：LINE-1在对照组细胞中出现高甲基化状态,而在染毒组细胞中呈现低甲基化状态。 结论：1、确定了最佳染毒浓度以及时间,成功建立了体外染烟致BEAS-2B细胞恶性转化的模型。2、染毒后细胞出现了细胞增殖失控,具备了恶性特征且具有裸鼠成瘤性。3、抑癌基因RASSFIA和FHIT启动子区出现高甲基化状态,重复序列LINE-1则出现低甲基化状态,同时基因RASSF1A和FHIT的表达在染毒组发生了改变,这可能是香烟烟雾染毒导致细胞恶性转化的机制之一,也为筛选香烟烟雾致肺癌的早期分子标志物提供了一定的理论依据。
【关键词】：BEAS-2B细胞 香烟烟雾 抑癌基因 甲基化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114;R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 第一部分 香烟烟雾染毒诱导BEAS-2B细胞恶性转化模型建立及生物学特征研究11-20
• 材料与方法11-15
• 结果15-17
• 讨论17-20
• 第二部分 香烟烟雾染毒诱导BEAS-2B细胞恶转过程中细胞的恶性程度及甲基化转移酶的表达改变20-32
• 材料与方法20-25
• 结果25-30
• 讨论30-32
• 第三部分 香烟烟雾染毒诱导BEAS-2B细胞恶转过程中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因甲基化及基因表达研究32-43
• 材料与方法32-37
• 结果37-40
• 讨论40-43
• 结论43-44
• 参考文献44-49
• 综述 癌危险因素以及抑癌基因甲基化与肺癌的关系49-56
• 参考文献53-56
• 研究生期间科研经历发表的文章56-57
• 中英文缩写词表57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：652668