芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷对AngⅡ诱导的HUVECs氧化损伤模型作用机制

发布时间：2017-08-16 21:31

  本文关键词：芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷对AngⅡ诱导的HUVECs氧化损伤模型作用机制

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【摘要】：本文首先利用血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立氧化损伤模型模拟体外高血压细胞损伤模型,其次通过考察细胞形态、细胞活性、微观结构、细胞凋亡以及检测细胞功能中氧化损伤标志物丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力来评价芹菜苷与3-甲氧基芹菜苷的修复效果,进而选取功能活性较强的芹菜苷,再通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)等技术来研明芹菜苷对血压调节的细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路的影响,从而阐明芹菜苷在血管内皮细胞中发挥修复作用的途径,为芹菜黄酮调节血压研究提供理论基础,同时为高血压病患者日常膳食提供有效的建议。主要的实验结果及结论如下：(1)以HUVECs为模型细胞,Ang Ⅱ为诱导剂,筛选诱导剂的浓度和诱导时间对HUVECs氧化应激损伤的影响。实验发现Ang Ⅱ能明显的诱导内皮细胞的氧化损伤,主要表现为细胞形态变化,细胞器细胞膜结构损伤,细胞活性下降,凋亡率上升,细胞脂质过氧化增加,细胞的分泌功能如NO释放率、eNOS、SOD活力降低。其中1μmol/L AngⅡI诱导12 h时各项指标为细胞活性为65.11%,NO含量43.57 μmol/L, TNOS活力为6.99U/mgprot, eNOS活力为1.89U/mgprot,MDA含量为7.46 nmol/mgprot, SOD活力为144.88U/mgprot,细胞凋亡率为(41.5±2.6)%,微观结构显示核膜皱缩,核仁消失,胞浆内出现大量空泡状结构,线粒体或者细小或者肿胀,粗面内质网扩张数目较少,部分核糖体丢失,平面内质网扩张,但细胞未解体,仍然保持细胞结构。(2)以芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷标准品为研究对象,通过与建立损伤模型相同的技术考察两者对模型的修复情况。实验发现两者均可以增加细胞活力,增加NO释放量,清除自由基,减少细胞内过氧化物的产生,降低细胞凋亡率,修复细胞器细胞膜结构等,且上述功能在芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷浓度低于50 μmol/L时随时间呈剂量依赖增加关系,高于50 μmol/L时修复细胞的功效开始降低。说明两者均具有一定程度的修复损伤的内皮细胞作用。具体结果为：50 μmol/L芹菜苷修复12h时,各指标分别为细胞活力79.07%,NO含量为139.22 μmol/L, TNOS活力为26.32 U/mgprot, eNOS活力为16.32 U/mgprot, MDA含量为5.47 nmol/mgprot, SOD活力为51.51 U/mgprot,细胞凋亡率下降到(14.7±1.2)%,微观结构显示细胞核仁基本完整,胞浆内空泡减少,粗面内质网及核糖体数目未见减少,形态未见明显病变。50μmol/L3-甲氧基芹菜苷修复12 h时,各指标分别为细胞活力64.50%,NO含量为78.88 μmol/L, TNOS活力为19.94 U/mgprot, eNOS活力为12.41 U/mgprot,MDA含量为7.93 nmol/mgprot, SOD活力为44.32 U/mgprot,细胞凋亡率下降到(33.7±1.7)%,微观结构显示细胞器数量减少,仍有部分线粒体肿胀。说明3-甲氧基芹菜苷在一定程度上同样具有减缓血压症状的作用,其发挥作用的规律与芹菜苷类似,但效果不如芹菜苷。综合两者的作用效果,最终选择50 μmol/L芹菜苷修复12 h来研究芹菜苷对ERK1/2信号通路的作用。(3)ERK1/2信号通路是与高血压相关的信号通路之一。实验发现,在AngⅡ诱导的模型中加入芹菜苷,ERK1、ERK2的mRNA表达分别降低7.84%、22.28%,磷酸化蛋白表达分别降低30.91%、11.33%,说明芹菜苷可以抑制磷酸化ERK1、ERK2的mRNA和蛋白表达来发挥降血压作用。实验还发现芹菜苷能够抑制ERK1/2的下游产物ACE的mRNA和蛋白表达,进而减少细胞损伤,同时芹菜苷能够激活eNOS的mRNA和蛋白表达,发挥释放NO的作用,从而修复内皮细胞损伤。这种效果在加入ERK1/2特异性抑制剂U0126后更为明显。
【关键词】：高血压 HUVEC 芹菜苷 3-甲氧基芹菜苷 Ang Ⅱ ERK1/2信号通路
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R151
【目录】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 符号说明9-10
• 第一章 绪论10-20
• 1.1 细胞氧化损伤模型10-11
• 1.1.1 细胞氧化损伤10
• 1.1.2 细胞模型的建立10-11
• 1.1.3 细胞模型的应用11
• 1.2 人脐静脉内皮细胞的氧化损伤模型11-14
• 1.2.1 内皮细胞概述12
• 1.2.2 内皮细胞与高血压的关系12
• 1.2.3 人脐静脉内皮细胞特点12-13
• 1.2.4 人脐静脉内皮细胞损伤机制13-14
• 1.3 黄酮类化合物功效14-15
• 1.4 芹菜黄酮功效15-17
• 1.5 黄酮类物质对ERK1/2信号通路的调控17-18
• 1.6 研究目的与意义18
• 1.7 研究内容18-20
• 第二章 ANG Ⅱ体外诱导HUVECS氧化损伤模型的建立20-40
• 2.1 材料与仪器20-22
• 2.1.1 实验材料20
• 2.1.2 实验试剂20-21
• 2.1.3 主要仪器和设备21
• 2.1.4 主要试剂制备21-22
• 2.2 实验方法22-29
• 2.2.1 HUVECs的培养22-23
• 2.2.2 实验分组与处理23
• 2.2.3 细胞形态观察23
• 2.2.4 细胞活性测定23-24
• 2.2.5 总蛋白提取与浓度测定24-25
• 2.2.6 NO的测定25
• 2.2.7 NOS的测定25-26
• 2.2.8 MDA的测定26-27
• 2.2.9 SOD的测定27-28
• 2.2.10 细胞超微结构的观察28
• 2.2.11 细胞凋亡测定28-29
• 2.2.12 数据分析29
• 2.3 结果与讨论29-37
• 2.3.1 细胞形态的观察29-30
• 2.3.2 细胞活性30
• 2.3.3 总蛋白含量30-31
• 2.3.4 NO含量31-32
• 2.3.5 NOS活力32-33
• 2.3.6 MDA含量33-34
• 2.3.7 SOD活力34
• 2.3.8 细胞超微结构34-36
• 2.3.9 细胞凋亡36-37
• 2.4 讨论37-38
• 2.5 小结38-40
• 第三章 芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷对HUVECS氧化损伤模型的修复40-55
• 3.1 材料、试剂与仪器40-41
• 3.1.1 主要试剂40
• 3.1.2 主要仪器40-41
• 3.2 试验方法41-42
• 3.2.1 实验分组与处理41-42
• 3.2.2 各指标测定方法42
• 3.2.3 数据分析42
• 3.3 结果与讨论42-52
• 3.3.1 细胞形态42-43
• 3.3.2 细胞活性43-44
• 3.3.3 总蛋白含量44
• 3.3.4 NO的含量44-46
• 3.3.5 NOS的活力46-47
• 3.3.6 MDA的含量47-49
• 3.3.7 SOD的活力49-50
• 3.3.8 细胞超微结构50-51
• 3.3.9 细胞凋亡51-52
• 3.4 讨论52-54
• 3.5 小结54-55
• 第四章 芹菜苷对HUVECS损伤模型中ERK1/2信号通路的作用55-72
• 4.1 材料、试剂与仪器55-56
• 4.1.1 试验材料55
• 4.1.2 主要试剂55-56
• 4.1.3 主要仪器56
• 4.2 试验方法56-64
• 4.2.1 试剂配制56-57
• 4.2.2 细胞培养57
• 4.2.3 实验分组与处理57-58
• 4.2.4 实时定量逆转录聚合酶链式反应58-61
• 4.2.5 免疫蛋白印迹(Western blotting)61-63
• 4.2.6 统计学分析63-64
• 4.3 结果与讨论64-69
• 4.3.1 ERK1/2 mRNA的溶解曲线64
• 4.3.2 芹菜苷对细胞中ERK1/2 mRNA和蛋白表达量的影响64-67
• 4.3.3 ACE mRNA的溶解曲线67
• 4.3.4 芹菜苷对细胞中ACE mRNA表达量的影响67-68
• 4.3.5 芹菜苷对细胞中eNOS mRNA、蛋白表达量的影响68-69
• 4.4 讨论69-70
• 4.5 小结70-72
• 全文总结72-74
• 参考文献74-81
• 致谢81-82

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本文编号：685642