两种典型OPFRs对PC12细胞的神经毒性及其机制探究

发布时间：2017-08-30 21:23

  本文关键词：两种典型OPFRs对PC12细胞的神经毒性及其机制探究

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【摘要】：随着世界范围内溴代阻燃剂的广泛禁用,有机磷酸酯类阻燃剂的使用量大幅增加,这些阻燃剂作为添加剂加入到人类生产生活各种产品中,经过渗透、磨损逐渐渗入到周围环境中,对人类和野生动物产生危害。科学家们对有机磷酸酯类阻燃剂进行调查研究,在水、土壤、鱼类、鸟类体内检测到了各种浓度范围的有机磷酸酯类阻燃剂,且发现其具有内分泌和甲状腺毒性,但对其神经毒性及其机制的研究尚少。本课题选取磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl)phosphate,TDCPP)和三(2-羧乙基)磷(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)两种典型有机磷酸酯类阻燃剂为研究材料,以PC12神经元细胞为模型,开展了TDCPP和TCEP的神经毒性研究,并初步探索其可能的神经毒性作用生物分子机制。以NGF刺激分化的PC12细胞为体外培养神经细胞模型,选用暴露浓度为0-75μM的TDCPP和0-400μM的TCEP,分别对PC12细胞进行0-6天的染毒处理。采用倒置显微镜对细胞形态进行观察,利用MTT法对细胞生存率进行测定,运用流式细胞仪对细胞凋亡和细胞内Ca2+改变进行荧光检测;采用Western-Blotting(WB)技术对PC12细胞神经生长相关的关键蛋白(如Ca MK2、GAP43、tubulin、NF-H),以及MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平进行检测和分析。并采用Ca MK2蛋白抑制剂KN93抑制Ca MK2活化后检测MAPK通路磷酸化水平的改变,以期进一步揭示MAPK通路与Ca MK2蛋白磷酸化之间的关系。研究分为三个部分,培养细胞分组及主要研究结果如下:一、TDCPP/TCEP染毒PC12细胞导致其神经毒性检测TDCPP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TDCPP染毒1μM、5μM、15μM、20μM、25μM、50μM、75μM组共8组,染毒6天;检测TCEP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TCEP染毒15μM、20μM、40μM、80μM、150μM、200μM、400μM组共8组,染毒6天;为检测染毒后生存率时间效应,染毒浓度为50μM TDCPP,细胞分别持续染毒0-6天,各持续染毒时间段均设有正常对照组,且每组设6复孔。实验中对各组细胞实时观察并拍照记录。检测TDCPP染毒后细胞凋亡率的实验细胞分组为0μM、5μM、15μM、25μM、50μM TDCPP染毒组,染毒时间为持续染毒3天和持续染毒6天,每组设3复孔。显微镜观察结果显示在TDCPP或TCEP染毒作用下,PC12神经细胞的形态均发生改变,神经突触长度变短数量减少,神经细胞间的神经丝连接减少、形成的神经结节也减少,神经细胞变圆变小,生存数量减少;不同染毒浓度的TDCPP/TCEP暴露下,PC12细胞生存率均减少,存在剂量效应关系;不同染毒持续时间的TDCPP暴露下,PC12细胞生存率亦减少,存在时间效应关系;不同浓度和不同染毒时间TDCPP暴露下,PC12细胞凋亡率呈现增多的趋势,且同样存在时间和剂量效应。这些结果均提示了TDCPP/TCEP对PC12细胞具有神经毒性,且表现在发育毒性和细胞毒性两个方面。二、TDCPP/TCEP导致PC12细胞神经毒性的生物标志物实验用PC12细胞以1×105细胞密度接种至6孔培养板中,隔天对细胞进行换液,培养液含终浓度为20μg/L的NGF以刺激分化PC12细胞。培养至细胞铺率达70%后对细胞进行染毒换液。细胞分组为正常对照组、溶剂对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组;或正常对照组、溶剂对照组、TCEP 40μM、80μM、150μM、200μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,持续染毒6天。分别对各组PC12细胞进行收集,提取蛋白后采用WB技术检测目标蛋白。结果显示OPFRs影响PC12细胞内调节蛋白Ca MK2、GAP43的翻译水平,TDCPP使其表达量相比正常细胞降低约20%-40%,且与TDCPP染毒存在剂量效应关系;TCEP使GAP43表达量相比正常细胞降低约50%,而CAMK2的表达水平呈现增长的趋势。另外,PC12细胞内骨架蛋白tubulin、NF-H的翻译水平在TDCPP作用下最大降幅约为30%,且同样与TDCPP染毒存在剂量效应关系;而TCEP作用下骨架蛋白tubulin翻译水平同样降低约20%-30%,NF-H翻译水平却呈现增多的趋势,最多相比正常组增加约1倍。所以,在OPFRs作用下神经生长相关蛋白翻译水平的改变,可引起神经细胞生长发育受损,损伤神经细胞PC12的正常形态,阻碍其发挥正常功能,从而引起PC12细胞神经毒性,而以上几类与神经相关目标蛋白,可能成为其神经毒性效应主要的生物标志物。三、TDCPP导致PC12细胞神经毒性的可能分子生物机制流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度水平的改变细胞分组为正常对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,分别持续染毒1-6天;WB检测Ca MK2、MAPK通路蛋白及其磷酸化水平的改变细胞分组为:①持续染毒4天,组别为正常对照组、TDCPP 5μM、15μM、25μM、50μM组,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的剂量效应关系;②以50μM TDCPP染毒,分别持续染毒1-6天,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的时间效应关系。为确定Ca MK2与MAPK通路之间关系实验细胞分组为正常对照组、正常对照+KN93处理组、25μM TDCPP染毒组、25μM TDCPP+KN93处理组、50μM TDCPP染毒组、50μM TDCPP+KN93处理组。KN93抑制剂使用浓度为10μM,前处理时间为1小时,实验细胞连续染毒时间为6天。实验结果显示在TDCPP的作用下,PC12细胞内Ca2+稳态受到破坏,随着染毒剂量增加呈现细胞内Ca2+浓度水平增多的剂量效应关系,且随着染毒时间的延长细胞内Ca2+浓度水平同样呈现增多的趋势。Ca MK2和MAPK通路蛋白磷酸化水平增加,其中Ca MK2的磷酸化呈现明显的时间和剂量效应;JNK和p38蛋白磷酸化水平增多表现相似的变化趋势,存在明显的剂量效应;Erk1/2蛋白磷酸化水平增多则存在明显的时间效应。另外TDCPP染毒的PC12细胞中,MAPK通路磷酸化水平增多可以被Ca MK2磷酸化抑制剂部分抑制,提示了MAPK信号通路与Ca MK2蛋白之间存在相互作用关系,暴露于TDCPP下的PC12细胞内MAPK信号通路部分被直接激活,部分由Ca MK2的磷酸化引起。由此,第二信使Ca2+、关键蛋白Ca MK2和MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平的改变,可能成为典型有机磷酸酯类阻燃剂TDCPP暴露所致PC12细胞产生神经毒性效应的生物分子作用机制。综上,可得出如下结论:TDCPP/TCEP可引起PC12细胞神经毒性,调节蛋白Ca MK2、GAP43和骨架蛋白tubulin、NF-H可能成为其重要的生物标志物,而信号通路参与调节其神经毒性,细胞内Ca2+浓度水平增多、Ca MK2磷酸化、MAPK信号通路激活可能成为TDCPP引起PC12细胞神经毒性的生物分子机制。本课题实验研究结果将丰富以TDCPP/TCEP为典型有机磷酸酯类阻燃剂的神经毒性的基础理论知识,并为OPFRs所致神经毒性评价提供了基础数据支持。
【关键词】：有机磷酸酯类阻燃剂 PC12细胞 钙依赖性钙调蛋白激酶2 促分裂原活化蛋白激酶
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一章 TDCPP/TCEP对PC12细胞的神经毒性效应16-24
• 1. 材料方法16-18
• 1.1 主要试剂16
• 1.2 材料仪器16-17
• 1.3 药物/试剂配备17
• 1.4 细胞培养17-18
• 1.5 实验方法18
• 2. 统计学处理18-19
• 3. 实验结果19-23
• 3.1 TDCPP/TCEP对PC12细胞生存率的时间、剂量效应影响19-21
• 3.2 TDCPP/TCEP对PC12细胞形态的影响21
• 3.3 TDCPP对PC12细胞凋亡率的时间、剂量效应影响21-23
• 4. 讨论分析23-24
• 第二章 TDCPP/TCEP引起PC12细胞神经毒性的蛋白生物标志物24-32
• 1. 材料方法24-27
• 1.1 主要试剂24-25
• 1.2 主要仪器25
• 1.3 细胞培养25
• 1.4 实验方法25-27
• 2. 统计学处理27
• 3. 实验结果27-30
• 3.1 TDCPP/TCEP对PC12细胞内Ca MK2、GAP43蛋白表达的影响27-28
• 3.2 TDCPP/TCEP对PC12细胞内tubulin、NF-H蛋白表达的影响28-30
• 4. 讨论分析30-32
• 第三章 TDCPP引起PC12细胞神经毒性的生物分子机制32-51
• 1. 材料方法32
• 1.1 主要试剂32
• 1.2 仪器材料32
• 1.3 细胞培养32
• 2. 统计学处理32-33
• 第一节 钙调通路参与TDCPP引起的PC12细胞神经毒性33-38
• 1. 实验方法33
• 1.1 流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度水平的改变33
• 1.2 WB检测Ca MK2蛋白磷酸化水平的改变33
• 2. 实验结果33-38
• 2.1 TDCPP对PC12细胞内Ca2+稳态的影响33-35
• 2.2 TDCPP对PC12细胞Ca MK2蛋白磷酸化的影响35-38
• 第二节 MAPK通路参与TDCPP引起的PC12细胞神经毒性38-46
• 1. 实验方法38
• 2. 实验结果38-46
• 2.1 TDCPP对PC12细胞JNK蛋白磷酸化的影响38
• 2.2 TDCPP对PC12细胞Erk1/2 蛋白磷酸化的影响38
• 2.3 TDCPP对PC12细胞p38蛋白磷酸化的影响38-46
• 第三节 Ca MK2磷酸化部分活化MAPK通路46-51
• 1. 实验方法46
• 2. 实验结果46-51
• 2.1 Ca MK2磷酸化抑制对暴露于TDCPP的PC12细胞生存率影响46
• 2.2 Ca MK2磷酸化抑制对暴露于TDCPP的PC12细胞MAPK通路磷酸化影响46-51
• 讨论分析51-54
• 总结与展望54-56
• 参考文献56-63
• 文献综述63-70
• 参考文献67-70
• 论著全文70-90
• 个人简历90-91
• 致谢91

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 塔娜;房彦军;郭小娟;林本成;张华山;田蕾;袭著革;;磷酸三(2-氯乙基)酯阻燃剂对稀有泩鲫的毒性的初步观察[J];解放军预防医学杂志;2013年05期

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本文编号：761545