经味觉通路的纳米氧化锌和纳米二氧化钛颗粒的中枢神经毒性

发布时间：2017-09-02 02:10

  本文关键词：经味觉通路的纳米氧化锌和纳米二氧化钛颗粒的中枢神经毒性

  更多相关文章： 纳米颗粒 氧化锌 二氧化钛 组织分布 神经毒性 氧化应激

【摘要】：研究背景“纳米技术”被认为是21世纪的关键技术之一,它在现代社会的发展中起着革命性的变化。“纳米材料”被定义为一种存在于非结合状态,或团聚状态,或与一个或多个聚结的材料,其外部尺寸范围在1-100纳米。随着纳米技术的快速发展,纳米颗粒(Nanoparticles, NPs)普遍应用于工业,农业,化妆品,医疗保健和生命科学领域。然而,纳米材料的使用也伴随着一定的安全隐患。由于纳米材料的大小近似于DNA、蛋白质、病毒和生物分子,纳米颗粒具有独特的生物学效应,这一机制目前还不为人了解。尽管目前很多研究在探寻纳米材料和生物宏观分子、细胞、器官和组织的相互作用,也仅仅初步阐述了纳米材料的生物毒性效应,可能是由氧化应激机制和炎症机制所引起。同时,纳米材料的物理化学特性对其毒性也有着重要的影响,这些特性包括大小、形状、表面电荷、化学组成、表面修饰、金属杂质、附聚和分散、降解性能,以及“蛋白冠”的形成。最近的体内体外试验数据表明,纳米颗粒可以通过呼吸道吸入、消化道吸收、皮肤接触、药物注射、种植体释放,或者其他方式进入人体,并且通过淋巴循环、血液循环或者神经到达第二靶器官,进而产生生物毒性效应。近年来体内实验发现,纳米颗粒还可通过神经进入组织,吸入或者鼻内滴入的纳米颗粒能够通过嗅上皮及相关的神经元直接进入大脑的嗅叶,从而进入中枢神经系统,诱发显著的炎症相关反应。这条通道包括嗅觉器官或者三叉神经系统,通道起始于脑区,绕开血脑屏障,终于鼻腔的嗅上皮或者呼吸上皮。鼻内滴注纳米二氧化钛颗粒,颗粒可以通过嗅神经通路进入大脑皮层和海马。此外,亚急性和亚慢性吸入纳米氧化锌颗粒,颗粒会高度溶解在肺部组织,并且纳米氧化锌可以通过易位进入血液循环。神经系统的内脏感觉传导通路分为一般内脏感觉传导通路和特殊内脏感觉传导通路,其中,嗅觉和味觉同属于特殊内脏感觉传导通路,二者具有一定的相似性。鉴于纳米颗粒可以通过鼻腔滴注进入嗅细胞,从而进入嗅觉神经通路,引起动物体内的神经毒性作用,那么舌体滴注纳米颗粒是否也可以通过味蕾进入味觉神经通路,引起动物体内的神经毒性作用呢?因此,本研究拟采用成年雄性Wistar大鼠进行舌体滴注,分别选用纳米氧化锌和纳米二氧化钛混悬液,隔天给药30 d,探索纳米颗粒能否通过舌体滴注进入味觉神经通路,继而进入中枢神经系统,并评价其中枢神经毒性的影响。研究目的1. 舌体滴注纳米氧化锌和纳米二氧化钛两种混悬液,探索纳米颗粒能否通过味觉神经通路进入动物体内2. 评估舌体滴注的纳米颗粒通过味觉神经通路在动物体内沉积的含量3.检测氧化应激相关指标,评估纳米颗粒的中枢神经毒性作用4.脑组织形态学观察和免疫组化分析,探索纳米颗粒进入动物体内对中枢神经毒性的影响5.采用水迷宫实验探索纳米颗粒对大鼠空间记忆及学习认知功能的影响本论文主要包括以下两章内容：第一章纳米颗粒通过味觉神经通路进入Wistar大鼠材料与方法1.纳米材料的表征1)透射电子显微镜(TEM)观察表面形貌使用TEM观察纳米氧化锌和纳米二氧化钛的形态和结构,计算纳米氧化锌和纳米二氧化钛的平均粒径。2)纳米材料化学成分的分析采用X线光谱仪(EDS)对纳米氧化锌和纳米二氧化钛进行化学成分分析。3)X射线衍射物相分析(XRD)采用XRD设备分析纳米氧化锌和纳米二氧化钛的晶相,在室温下,采用Ni过滤的Cu-Ka射线进行。4)纳米材料的Zeta电位和团聚程度分析分别将纳米氧化锌和纳米二氧化钛纳米材料分散于无菌水中,漩涡震荡1mmin,配置成纳米氧化锌和纳米二氧化钛混悬液。使用Zeta电位测定仪测量纳米颗粒悬液的Zeta电位和水合粒径。2.动物模型的构建及神经和脑组织元素含量检测1)配液用天平分别称量1.5 g的纳米氧化锌和纳米二氧化钛粉末,分别倒入装有30mL无菌水的100 mL血清瓶中,用标签纸在瓶盖上分别标记为“纳米氧化锌”和“纳米二氧化钛”。使用漩涡混匀器大力混匀,溶液浓度为50 mg/mL。将装有纳米氧化锌和纳米二氧化钛混悬液的血清瓶放入水浴锅进行加热,当水浴锅温度达到85-100℃时,用天平分别称量0.3 g羟丙基甲基纤维素(HPMC)按照1%的比例,分别加入到纳米氧化锌和纳米二氧化钛血清瓶中。2)超声混匀将配置好的混悬液放入超声机中,频率调至95%,温度调至40℃,超声90min,反复多次超声。每次给药前将配置好的混悬液再次加热,用漩涡混匀器大力混匀,瓶底无沉淀后,放入超声机中超声约30 min,直至药物均匀分散,无沉积,无明显团聚现象即可。3) 动物的选择从南方医科大学动物中心购买体重为120-150 g的成年雄性Wistar大鼠30只,随机分组,其中纳米氧化锌组、纳米二氧化钛组、对照组各10只,要求大鼠身体健康,活动度正常,毛发色泽及密度正常。4)麻药的配制用天平称量1.0 g的戊巴比妥钠,放入装有100 mL生理盐水的血清瓶中,麻药浓度为1%,振荡混匀,直至无肉眼可见的颗粒物。5)给药腹腔注射1%戊巴比妥钠0.48 mL/100 g,麻醉起效时间3-10 min,持续时间约2-3h。用微型注射器根据动物体重在舌体上逐滴滴加5 mg/100 g纳米氧化锌和纳米氧化钛混悬液,给药时间为第1、3、5、7……27、29 d,隔天给药,第30 d麻醉断颈处死,提取组织检测。6)神经组织和脑元素含量检测提取大鼠的鼓索和舌咽神经、小脑、脑干、大脑皮层、海马,采用ICP-MS检测纳米氧化锌组Zn元素的含量,纳米二氧化钛组大Ti元素的含量,对照组Zn元素和Ti元素的含量。7)统计分析采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计学分析,测定结果均以x±s表示,组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA),检验方差齐性,如果方差齐则对样本均数进行两两比较的LSD检验；如果方差不齐则采用Dunnett'sT3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准α=0.05。3.脑组织及神经组织透射电子显微镜的检测分别提取纳米氧化锌组,纳米二氧化钛组和对照组大鼠的海马,大脑皮层和神经组织(鼓索),放入固定液中固定,然后取出包埋,切片,观察组织中是否存在纳米颗粒,及组织的损伤情况。结果1.表征结果显示,纳米氧化锌和纳米二氧化钛颗粒纯度高,无杂质,粒径为50 nm,制备的纳米氧化锌和纳米二氧化钛混悬液分散均匀,无明显团聚或沉淀。2.采用ICP-MS检测纳米氧化锌组Zn元素含量,纳米二氧化钛组Ti元素含量,与对照组的Zn元素和Ti元素分别进行比较,发现实验组神经组织和脑组织(小脑,脑干,大脑皮层,海马)的Zn元素和Ti元素明显高于对照组,差异具有统计学意义。3.脑组织和神经组织的TEM结果显示,纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层均可见组织中有散在的纳米颗粒沉积,部分细胞及细胞器形态改变,如线粒体肿胀、嵴断裂,内质网肿胀,胶质细胞出现核固缩,核固裂,神经元凹陷,胞质空,板层松解,形成空泡,髓鞘轴浆萎缩,形成空泡,还可见自噬体、溶酶体形成。对照组未见明显的纳米颗粒沉积,细胞及细胞器形态良好。第二章纳米颗粒通过味觉神经通路入脑的中枢神经毒性材料与方法1.纳米颗粒对脑组织的氧化应激损伤1)将冰冻的样本取出,分别提取纳米氧化锌,纳米二氧化钛,对照组的脑组织0.2 g,生理盐水稀释,尽可能保证样品在4℃环境中,使用组织匀浆机制备组织匀浆(1：9 w/v),约3-5次,每次间隔30-60s,共约10 min,离心,转速2500 r/min,收集上清液。2)分别检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性,丙二醛(MDA)的含量,还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)的含量,谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。根据说明书添加相应试剂。在96孔板上进行种板,采用荧光酶标仪测量荧光强度,激发和发射波长。3)氧化应激相关基因的表达收集不同组大鼠的脑组织,制作组织匀浆后,提取总RNA,即刻逆转录成cDNA,采用qRT-PCR法检测氧化应激相关基因,如Dhcr7、Cyp51、Gsr、 Nox1、Sod2、Nqo1、Fmo2表达水平的改变。选择大鼠的β-actin基因作为内参。4)统计分析采用SPSS20.0软件对所得数据进行统计学分析,测定结果均以x±s表示,组间采用单因素方差分析,检验方差齐性,如果方差齐则对样本均数进行两两比较的LSD检验；如果方差不齐则采用Duinnett's T3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准a=0.05。2.脑组织形态学观察及免疫组化分析1)将取出的脑组织固定,石蜡包埋,用切片机切片,切片厚度约4μm。2)将切片进行苏木精-伊红染色(HE),正置光学显微镜下观察脑组织形态学改变。3)免疫组化分析,采用Ki-67观察增殖细胞的存在,采用八羟脱氧鸟苷酸(8-OHDG)观察DNA损伤情况,采用神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)观察星形胶质细胞的存在,随机选择大脑皮层和海马组织的区域,进行拍照(棕色)。3.动物行为学分析纳米颗粒产生的中枢神经毒性1)水迷宫为一个直径约2.0 m的圆钢管混凝土,深度约80 cm,水温基本恒定在26℃,填满水后添加不透明的黑色墨水。水池分为四个象限：东北(NE),东南(SE)、西南(SW)和西北(NW)。内置一个圆形平台(直径10 cm),置于象限中央,水面高度控制在圆形平台上方2 cm的位置。2)记录大鼠1-7 d在水迷宫寻找平台所用的时间和运动轨迹。3)采用SPSS20.0软件对所得数据进行统计学分析,测定结果采用重复测量方差分析和多元方差分析,进行不同时间点和不同组间的两两比较,检验方差齐性,检验水准a=0.05。4)学习记忆相关基因的表达收集不同组大鼠的脑组织,制作组织匀浆后,提取总RNA,即刻逆转录成cDNA,采用qRT-PCR法检测学习记忆相关基因,如Sgk1、Drd2、Trappc4、 Gnaq表达水平的改变。选择大鼠的β-actin基因作为内参。结果1.纳米颗粒对脑组织氧化应激损伤的检测1)纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组SOD的活性均显著低于对照组,提示组织抗氧化能力下降。纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组MDA的含量均显著高于对照组,提示组织出现了脂质过氧化。纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组GSH,GSH-Px,GSH/GSSG的含量均显著低于对照组,提示组织抗氧化能力下降,出现了氧化应激损伤。2)与对照组比较,两组实验组Dhcr7表达显著下调、Cyp51和Nqo1表达显著上调、纳米氧化锌组Gsr和Fmo2表达显著上调、纳米二氧化钛组Sod2表达显著上调、两组实验组Noxl表达水平无显著性差异,提示组织氧化应激相关基因表达水平改变,可能出现了氧化应激损伤。2.脑组织形态学观察及免疫组化分析1)在正置显微镜下观察可见,HE染色后的纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马中,可见组织松解,出现裂隙,细胞排列松散,对照组组织未见明显异常,说明实验组脑组织发生了一定程度的病理改变。2)在正置显微镜下观察可见,Ki-67染色后的纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马中,增殖细胞数目较对照组少；8-OHDG染色后的纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马中,DNA损伤的细胞数目较对照组多；GFAP染色后的纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马中,星形胶质细胞数目较对照组多；说明实验组脑组织出现了损伤,细胞增殖能力下降,可能出现神经退化。3.纳米颗粒产生的脑毒性对动物行为学分析的影响1)在第1、2、3、5、8 d,纳米氧化锌组大鼠寻找平台的时间明显长于对照组,具有统计学差异。在第6 d,纳米氧化锌组大鼠经过平台并停留的时间明显短于对照组,具有统计学差异。2)在第2、3、4、5、8 d,纳米二氧化钛组大鼠寻找平台的时间明显长于对照组,具有统计学差异。在第6 d,纳米二氧化钛组大鼠经过平台并停留的时间明显短于对照组,具有统计学差异。3)与对照组比较,两组实验组Sgk1、Drd2、Trappc4、Gnaq表达均显著下调,提示脑组织学习记忆相关基因的表达改变,可能具有中枢神经毒性。结论1.通过对Wistar大鼠舌体滴注纳米颗粒的方式给药30 d,纳米颗粒可在脑组织中沉积。2. 采用氧化应激试剂盒进行检测,发现纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组脑组织清除超氧阴离子自由基的SOD活性降低,脂质过氧化产物MDA含量升高,GSH,GSH-Px,GSH/GSSG下降,提示脑组织抗氧化能力下降,发生了氧化应激的损伤。3.组织形态学观察发现,纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马组织松解,细胞排列松散,提示脑组织发生了病理改变。4. 免疫组化分析,纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大脑皮层和海马组织细胞增殖能力下降,出现了DNA损伤,可能伴有神经退化。5.氧化应激相关基因表达水平部分出现了上调或下调,说明脑组织氧化应激相关基因表达水平改变,进一步提示脑组织发生了氧化应激损伤。6.行为学分析发现,纳米氧化锌组和纳米二氧化钛组大鼠的认知和学习记忆能力较对照组下降,说明纳米颗粒引起了脑组织的学习记忆和认知功能的障碍。7.学习记忆相关基因表达水平均出现了下调,说明脑组织学习记忆相关基因表达水平改变,提示脑组织在学习记忆和认知功能方面出现了损害。
【关键词】：纳米颗粒 氧化锌 二氧化钛 组织分布 神经毒性 氧化应激
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-25
• 第一章 纳米颗粒通过味觉神经通路进入Wistar大鼠25-42
• 实验一 纳米材料的表征26-33
• 实验二 动物模型的构建及神经和脑组织元素含量检测33-38
• 实验三 脑组织和神经组织透射电子显微镜检测38-42
• 第二章 纳米颗粒通过味觉神经通路入脑的中枢神经毒性42-64
• 实验一 纳米颗粒对脑组织的氧化应激损伤42-51
• 实验二 脑组织形态学观察及免疫组化分析51-59
• 实验三 动物行为学分析纳米颗粒产生的中枢神经毒性59-64
• 参考文献64-72
• 全文总结72-74
• 附录74-75
• 攻读硕士学位期间成果75-77
• 致谢77-78

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