EMA-qPCR检测公共场所气溶胶中存活的嗜肺军团菌

发布时间：2017-09-15 07:17

  本文关键词：EMA-qPCR检测公共场所气溶胶中存活的嗜肺军团菌

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【摘要】：目的建立叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide, EMA)与荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,目结合检测公共场所气溶胶中存活嗜肺军团菌的方法。 方法在实验室用培养的嗜肺军团菌进行实验,得到EMA处理的最适条件,即在不影响活菌PCR信号的前提下,尽可能的抑制死菌的PCR信号；在实验室采集嗜肺军团菌气溶胶模拟样品,设EMA处理组和对照组,验证其检测活菌的效果；最后,将本方法在公共场所进行现场应用实验。 结果EMA终浓度在2.5μg/ml、4-C孵育5min、光照5min的处理,可以在不影响活菌的情况下使死菌qPCR的信号降低2lg copies/ml左右,即可以抑制99%的死菌的PCR扩增。杂菌的存在不影响EMA-qPCR对存活嗜肺军团菌的检出。当死菌和活菌的比例不超过1000：1时,EMA-qPCR可以实现对存活嗜肺军团菌的定量检测。公共场所气溶胶样品EMA处理组嗜肺军团菌的阳性率35%(21/60),对照组57.5%(23/40)。在来自同一采样点的11对配对样品中,有1对样品EMA处理结果与对照组结果相等,5对样品的EMA处理组的qPCR结果低于对照组,qPCR信号平均降低0.58lg copies/ml,其余样品EMA处理组结果略高。 结论EMA-qPCR可以用于公共场所气溶胶中存活嗜肺军团菌的快速定量检测,检测结果不受死亡的嗜肺军团菌、杂菌和气溶胶样品中其他成分的影响。
【关键词】：叠氮溴乙锭 荧光定量PCR 嗜肺军团菌 公共场所 气溶胶
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R126.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-13
• 缩略语表13-15
• 第一章 引言15-39
• 1.1 军团菌15-19
• 1.1.1 军团菌病的散发、暴发和流行15-17
• 1.1.2 军团菌在环境中的污染情况17
• 1.1.3 公共场所、集中空调与军团菌17-18
• 1.1.4 军团菌与气溶胶18-19
• 1.1.5 小结19
• 1.2 军团菌的检测19-21
• 1.2.1 培养法19
• 1.2.2 PCR技术19-20
• 1.2.3 免疫学方法20-21
• 1.2.4 小结21
• 1.3 微生物活性方法概述21-29
• 1.3.1 DVC法21-22
• 1.3.2 基于RNA的PCR技术22-23
• 1.3.3 NASBA技术23-24
• 1.3.4 荧光原位杂交24
• 1.3.5 LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kit24-25
• 1.3.6 CTC/INT25-26
• 1.3.7 ChemChrome V626-27
• 1.3.8 5(6)cFDA27
• 1.3.9 MTT比色法27-28
• 1.3.10 ATP生物发光法28
• 1.3.11 小结28-29
• 1.4 EMA和PMA国内外研究现况29-35
• 1.4.1 EMA/PMA作用原理29-32
• 1.4.2 EMA/PMA方法的应用32-33
• 1.4.3 EMA/PMA作用效果的影响因素33-34
• 1.4.4 小结34-35
• 1.5 EMA/PMA-军团菌35-39
• 1.5.1 文献总结35-37
• 1.5.2 EMA/PMA的选择37
• 1.5.3 EMA溶剂的选择37-38
• 1.5.4 孵育温度的选择38
• 1.5.5 在环境样品中的应用38-39
• 第二章 研究目的和技术路线39-40
• 2.1 研究目的39
• 2.2 技术路线39-40
• 第三章 实验材料、试剂和仪器40-42
• 3.1 菌株40
• 3.2 耗材40
• 3.3 仪器40
• 3.4 普通PCR的引物40-41
• 3.5 荧光定量PCR的探针、引物和质粒标准品41-42
• 第四章 实验方法42-47
• 4.1 菌液制备与基本实验流程42-44
• 4.1.1 细菌培养和菌液制备42
• 4.1.2 EMA工作液的制备42
• 4.1.3 EMA处理42-43
• 4.1.4 DNA提取43
• 4.1.5 普通PCR和电泳43
• 4.1.6 荧光定量PCR43-44
• 4.2 EMA处理条件的优化44
• 4.2.1 EMA光照时间的优化44
• 4.2.2 EMA孵育时间的优化44
• 4.2.3 EMA浓度的优化44
• 4.3 杂菌的影响44-45
• 4.4 气溶胶模拟样品45-46
• 4.4.1 气溶胶吸收液的配制45
• 4.4.2 切割型浓缩器+Biosampler联合采样法45
• 4.4.3 气溶胶模拟样品的制备45-46
• 4.4.4 气溶胶模拟样品的处理46
• 4.5 EMA-qPCR方法的现场验证46-47
• 4.5.1 场所选择、现场采样点分布和气溶胶样品采集46
• 4.5.2 现场样品预处理46-47
• 第五章 实验结果47-61
• 5.1 细菌的培养计数和荧光定量PCR的标准曲线47-50
• 5.1.1 细菌的培养计数结果47
• 5.1.2 标准曲线、灵敏度、特异度47-50
• 5.2 EMA处理条件的优化50-53
• 5.2.1 孵育时间的优化50-51
• 5.2.2 光照时间的优化51-52
• 5.2.3 EMA浓度的优化52-53
• 5.3 杂菌的影响53-56
• 5.4 气溶胶模拟样品56-57
• 5.5 公共场所气溶胶样品检测结果57-61
• 第六章 结果讨论61-65
• 6.1 方法的选择61
• 6.2 EMA处理条件61-62
• 6.3 杂菌的影响62
• 6.4 气溶胶模拟样品的结果62-63
• 6.5 EMA-qPCR与其它活性检测方法的比较63
• 6.6 气溶胶样品采样方式63-64
• 6.7 气溶胶样品检测64-65
• 第七章 结论与展望65-67
• 7.1 结论65
• 7.2 研究的局限性与展望65-67
• 参考文献67-77
• 附1 DNA提取操作规程77-79
• 附2 公共场所环境现况调查表79-85
• 致谢85-86
• 个人简历86-88
• 研究生在读期间发表论文88-97

【参考文献】

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