大气颗粒物对血管内皮细胞的毒性作用及其相关机制研究

发布时间：2017-09-18 12:06

  本文关键词：大气颗粒物对血管内皮细胞的毒性作用及其相关机制研究

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【摘要】：近年来,北京空气污染现象日益严重,雾霾天气引发了社会各界的广泛关注。大气颗粒物作为主要的环境污染物已经严重影响了人们的日常生活和身体健康。作为大气颗粒物的重要组成部分,PM_(2.5)已经成为影响人体健康的重要威胁。目前,已经有大量的流行病学研究表明,PM_(2.5)通过呼吸道进入人体,能够引发人体的呼吸系统及心血管系统疾病,同时已有研究表明,PM_(2.5)的浓度与癌症的发生率也有密切联系。在PM_(2.5)引发人体心血管疾病的研究中,流行病学研究已经指出,高血压、动脉粥样硬化等疾病与PM_(2.5)的吸入浓度息息相关,也有毒理学研究表明,这些疾病的发生与PM_(2.5)造成血管内皮细胞的损伤有关,但PM_(2.5)导致动脉粥样硬化等心血管疾病的具体毒性作用机制还并未明确指出。为了进一步研究PM_(2.5)的毒性机制,本课题采用血管内皮细胞作为细胞模型,采集北京地区2014年1月的PM_(2.5),研究PM_(2.5)对血管内皮细胞的毒性作用及相关机制。同时,有研究提出,AhR是环境污染物诱导动脉硬化发生的可能机制之一,结合本课题的研究结果,为了进一步对其机制进行研究,本课题还利用CRISPR/Cas9系统构建了敲除人AhR基因的慢病毒质粒。本课题的研究结果表明,PM_(2.5)对细胞毒性明显,并且PM_(2.5)浓度与毒性存在剂量效应关系。PM_(2.5)可以导致细胞内微核产生率增加,进一步推测PM_(2.5)可能诱发细胞染色体损伤。利用透射电子显微镜观察PM_(2.5)在细胞中的作用位置和暴露于PM_(2.5)后的细胞超微结构变化,发现PM_(2.5)在细胞质和细胞核内均有存在且产生影响,尤其导致线粒体结构的改变。同时发现,PM_(2.5)会诱导细胞自噬的发生,自噬参与到了PM_(2.5)对细胞的毒性作用过程中并起到保护细胞的作用。在基因表达谱的检测中发现,PM_(2.5)诱发细胞中很多与炎症、氧化应激和血管功能障碍相关的基因的表达变化,其中,AhR及其靶基因CYP1B1的表达上调,HMOX1作为一种氧化应激的关键基因,它的表达上调表明HMOX1在细胞抗PM_(2.5)的损伤过程中可能起到了关键作用,凝血因子F3的表达上调可能是PM_(2.5)引发动脉硬化等心血管疾病的机制之一,其可能作为PM_(2.5)对人体心血管损伤的一种标志物。同时,PM_(2.5)还影响细胞p53信号通路、NF-kB信号通路等信号通路。同时,本课题利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了用于敲除人AhR基因的慢病毒质粒,为后续慢病毒的包装及人AhR基因的在PM_(2.5)引发心血管疾病尤其是动脉粥样硬化中的作用机制与功能研究奠定了基础。
【关键词】：大气颗粒物 PM_(2.5) 毒性机制 CRISPR-Cas9
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R122
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 主要英文缩写词7-12
• 第1章 绪论12-22
• 1.1 PM_(2.5) 简介12-14
• 1.1.1 PM_(2.5) 的定义及其来源12
• 1.1.2 PM_(2.5) 与人体健康效应12-13
• 1.1.3 PM_(2.5) 环境质量相关标准研究进展13-14
• 1.2 PM_(2.5) 的毒理学研究14-16
• 1.2.1 PM_(2.5) 的毒性作用机制14
• 1.2.2 PM_(2.5) 的毒性效应指标14-15
• 1.2.3 PM_(2.5) 的心血管毒性效应机制15-16
• 1.2.4 芳香烃受体及其在环境污染物对心血管毒性效应中的作用研究16
• 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用16-19
• 1.3.1 CRISPR/Cas9系统的组成结构16-17
• 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制17-18
• 1.3.3 CRISPR/Cas9系统在基因编辑优势18
• 1.3.4 CRISPR/Cas9系统在基因敲除及毒理学研究中的应用18-19
• 1.4 本课题的研究内容19-20
• 1.4.1 PM_(2.5) 对人血管内皮细胞HUVEC的毒性及其机制研究19
• 1.4.2 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的质粒构建19-20
• 1.5 本课题研究技术路线20-22
• 1.5.1 PM_(2.5) 对人血管内皮细胞HUVEC的毒性及其机制研究20
• 1.5.2 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的质粒构建20-22
• 第2章 PM_(2.5) 对人血管内皮细胞的毒性作用及自噬效应研究22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料22-24
• 2.2.1 实验细胞株22
• 2.2.2 主要实验试剂22-23
• 2.2.3 主要实验仪器23-24
• 2.3 实验方法24-29
• 2.3.1 大气PM_(2.5) 采集24
• 2.3.2 提取PM_(2.5) 颗粒24
• 2.3.3 细胞培养24-25
• 2.3.4 细胞染毒25
• 2.3.5 细胞存活率检测25
• 2.3.6 细胞凋亡检测25-26
• 2.3.7 细胞染色体损伤检测26
• 2.3.8 透射电镜观察PM_(2.5) 对HUVEC细胞超微结构的影响26
• 2.3.9 Western Blot检测自噬相关蛋白表达26-28
• 2.3.10 自噬效应研究28-29
• 2.3.11 数据统计学方法29
• 2.4 实验结果与分析29-35
• 2.4.1 PM_(2.5) 对HUVEC细胞存活率的影响29-30
• 2.4.2 PM_(2.5) 对HUVEC细胞凋亡的影响30-31
• 2.4.3 PM_(2.5) 对HUVEC细胞染色体损伤的影响31
• 2.4.4 PM_(2.5) 对HUVEC细胞超微结构的影响31-34
• 2.4.5 Western Blot检测自噬相关蛋白表达34
• 2.4.6 PM_(2.5) 对HUVEC细胞自噬效应研究34-35
• 2.5 讨论35-36
• 2.6 本章小结36-38
• 第3章 PM_(2.5) 对人血管内皮细胞的基因表达谱分析38-56
• 3.1 引言38
• 3.2 实验材料38-39
• 3.2.1 实验细胞株38
• 3.2.2 实验动物38
• 3.2.3 主要实验试剂38-39
• 3.2.4 主要实验仪器39
• 3.3 实验方法39-44
• 3.3.1 数字基因表达谱检测39
• 3.3.2 实时荧光定量PCR验证差异基因表达39-41
• 3.3.3 Western Bolt验证差异基因的蛋白表达41-43
• 3.3.4 ELISA检测小鼠血清中F3的表达情况43-44
• 3.3.5 数据统计学方法44
• 3.4 实验结果与分析44-53
• 3.4.1 差异表达基因分析44-47
• 3.4.2 Gene Ontology (GO)功能显著性分析47-48
• 3.4.3 KEGG pathway显著性富集分析48-50
• 3.4.4 实时荧光定量PCR检测基因差异表达50-51
• 3.4.5 Western Blot检测差异基因蛋白水平表达51-53
• 3.4.6 小鼠血清中F3的表达53
• 3.5 讨论53-54
• 3.6 本章小结54-56
• 第4章 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的质粒构建56-64
• 4.1 引言56
• 4.2 实验材料56-57
• 4.2.1 菌株和质粒56
• 4.2.2 工具和内切酶56
• 4.2.3 主要实验仪器56-57
• 4.3 实验方法57-59
• 4.3.1 gRNA序列的设计与合成57
• 4.3.2 寡核苷酸退火连接57
• 4.3.3 载体质粒lentiCRISPR-V2酶切及胶回收57-58
• 4.3.4 载体与目的片段的连接反应58
• 4.3.5 连接产物的转化58-59
• 4.3.6 小提并鉴定连接产物59
• 4.4 实验结果59-61
• 4.4.1 慢病毒质粒lentiCRISPR-V2酶切结果59-60
• 4.4.2 慢病毒质粒lentiCRISPR-V2胶回收结果60
• 4.4.3 重组质粒测序鉴定结果60-61
• 4.5 讨论61-63
• 4.6 本章小结63-64
• 结论64-66
• 参考文献66-72
• 攻读硕士期间所发表的学术论文72-74
• 致谢74

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本文编号：875426