酪胺酶联免疫检测方法的研究

发布时间：2017-09-21 18:25

  本文关键词：酪胺酶联免疫检测方法的研究

  更多相关文章： 酪胺 抗体 酶联免疫 检测 食品

【摘要】：酪胺是生物胺的一种,通过微生物对食品中游离酪氨酸的脱羧基作用形成。由于其含量变化可以客观地反映肉类腐败变质进程,因此它可以作为评价肉类新鲜度及腐败品质变化的重要指标。本文建立了一种具有高特异性的酶联免疫方法(ELISA)来检测食品中的酪胺。 采用甲醛法和戊二醛法,将酪胺分别与牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联,成功制备了酪胺的免疫原与包被原。通过免疫新西兰大耳白兔得到高效价的特异性抗血清,使用Protein A Sepharose-4B亲和层析法纯化抗血清得到酪胺多克隆抗体。本研究建立了间接竞争酶联免疫检测方法,对影响实验的各因素(包被原包被量,抗体稀释度,羊抗兔HRP标记二抗稀释度,封闭液等)进行了优化与筛选,最终确定包被原包被量为0.1μg/孔,抗体稀释度为1：500,羊抗兔HRP标记二抗的稀释度为1：15000,封闭液为0.5%乳粉/PBS溶液,抗体与标准品的孵育温度为25℃,在此工作条件下所获得的标准曲线灵敏度最高,稳定性最好。本研究所建立方法的灵敏度(IC50)为0.20±0.015mg/L,检测限(IC15)为0.02±0.004mg/L。所制备的抗体具有良好的特异性,与酪氨酸、苯乙胺、组胺、色胺均无交叉反应。 本研究通过对样品前处理条件的优化,消除了样品基质影响,得到一种简单可行的样品处理方法,并将建立的方法应用于猪肉、牛肉、鱿鱼、鳕鱼中酪胺的检测,样品检出限是1.20mg/kg。当酪胺标准品的添加浓度为12,24,60mg/kg时,所有样品的回收率在80.71-101.12%之间,且变异系数(n=3)均小于10%。所得结果与高效液相色谱法(HPLC)的检测值具有很好的一致性(R2=0.9893),这表明所建立的方法具有很好的准确性,本研究建立的酶联免疫方法成本低廉,操作简便,适合于食品中酪胺的快速检测。
【关键词】：酪胺 抗体 酶联免疫 检测 食品
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-6
• 目录6-8
• 1 前言8-24
• 1.1 食品安全现状8-9
• 1.2 生物胺简介9-15
• 1.2.1 生物胺的理化性质及毒性9-11
• 1.2.2 食品中生物胺的含量11-14
• 1.2.3 生物胺的限量标准14-15
• 1.3 酪胺简介15-20
• 1.3.1 酪胺的形成途径15
• 1.3.2 酪胺的药理学作用及危害15-16
• 1.3.3 酪胺的检测方法16-19
• 1.3.4 肉制品中酪胺的控制手段19-20
• 1.4 酶联免疫检测方法概述20-22
• 1.4.1 酶联免疫检测方法的原理20
• 1.4.2 酶联免疫检测方法的主要类型20-21
• 1.4.3 酶联免疫检测方法的应用21-22
• 1.5 论文研究的目的及意义22-23
• 1.6 论文的研究内容23-24
• 2 材料与方法24-39
• 2.1 实验材料24-28
• 2.1.1 实验药品及试剂24-25
• 2.1.2 实验仪器及材料25-26
• 2.1.3 基质样品26
• 2.1.4 常用溶液的配制26-28
• 2.2 实验方法28-39
• 2.2.1 酪胺免疫原的制备28-31
• 2.2.2 酪胺包被原的制备31
• 2.2.3 酪胺多克隆抗体的制备31-34
• 2.2.4 酪胺间接竞争ELISA方法的建立34-35
• 2.2.5 酪胺抗体特异性的测定35
• 2.2.6 样品基质的消除35-36
• 2.2.7 酪胺间接竞争ELISA性能指标的评价36-37
• 2.2.8 高效液相色潜法(HPLC)验证37-39
• 3 结果与讨论39-59
• 3.1 酪胺人工抗原的制备39
• 3.2 酪胺多克隆抗体的制备39-43
• 3.2.1 抗血清效价及特异性测定39-42
• 3.2.2 抗体的纯化42-43
• 3.3 酪胺间接竞争ELISA方法的建立43-49
• 3.3.1 包被原的包被量及抗体稀释倍数的优化43-44
• 3.3.2 羊抗兔HRP标记二抗稀释倍数的优化44-45
• 3.3.3 封闭液的确定45-46
• 3.3.4 标准品稀释液pH的确定46-47
• 3.3.5 抗体与标准品孵育温度的确定47
• 3.3.6 标准品稀释液中甲醇含量对间接竞争ELISA的影响47-48
• 3.3.7 酪胺间接竞争ELISA标准曲线的绘制48-49
• 3.4 酪胺抗体特异性的测定49-50
• 3.5 基质影响的消除50-53
• 3.5.1 提取溶剂的选择50-51
• 3.5.2 样品提取液稀释倍数的优化51
• 3.5.3 提取溶剂浓度的优化51-52
• 3.5.4 样品提取液掩蔽剂的优化52
• 3.5.5 样品提取液除脂次数的优化52-53
• 3.5.6 样品提取时间的优化53
• 3.5.7 酪胺间接竞争ELISA法的样品检测限53
• 3.6 间接竞争ELISA的性能指标评价53-56
• 3.6.1 检测限与灵敏度53-54
• 3.6.2 精密度54-55
• 3.6.3 稳定性55-56
• 3.7 高效液相色谱法对间接竞争ELISA方法有效性的验证56-59
• 3.7.1 酪胺高效液相色谱法标准曲线的绘制56-57
• 3.7.2 高效液相色谱法对酪胺间接竞争ELISA的验证57-59
• 4 结论59-60
• 5 展望60-61
• 6 参考文献61-68
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况68-69
• 8 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李苗云;朱应举;高晓平;柳艳霞;张秋会;;肉品中微生物对生物胺的影响[J];安徽农业科学;2008年07期

2 赵中辉;林洪;王林;李振兴;;常见水产品中生物胺的调查及分析[J];水产科学;2012年06期

3 陈宏靖;林淑云;;市售葡萄酒、啤酒中生物胺监测分析[J];福建分析测试;2011年06期

4 曹丽伟;孟建新;刘咏娟;;毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测生物胺[J];分析化学;2008年01期

5 邹阳;赵谋明;赵海锋;;高效液相色谱法同时测定酱油中的8种生物胺[J];现代食品科技;2012年05期

6 赵艳芬;漆邦林;;浅谈饮食与药物的相互作用[J];高校保健医学研究与实践;2005年02期

7 卢士玲;徐幸莲;舒蕊华;周光宏;陈艳萍;孙永明;;传统中式香肠中生物胺调查研究[J];食品与发酵工业;2009年10期

8 王凤芹;刘芳;孟勇;王道营;诸永志;徐为民;;TLC和HPLC法相结合分析盐水鸭中的生物胺[J];食品科学;2011年14期

9 栾光辉;刘春凤;李崎;;不同啤酒生物胺含量的比较[J];食品与发酵工业;2013年01期

10 胡超;程丽林;张长峰;何玉池;韩道财;;柱前衍生-反相高效液相色谱法测定草鱼肌肉中生物胺[J];食品科技;2013年05期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李志军;食品中生物胺及其产生菌株检测方法研究[D];中国海洋大学;2007年

，

本文编号：896154