基于2D和3D Caco-2细胞培养研究纳米氧化锌的安全性

发布时间：2017-09-22 16:19

  本文关键词：基于2D和3D Caco-2细胞培养研究纳米氧化锌的安全性

  更多相关文章： 纳米氧化锌 Caco-2细胞 三维 细胞毒性 炎症反应 细胞死亡

【摘要】：纳米氧化锌是一种应用前景广泛的多功能无机纳米材料,其具有粒径微小、比表面活性高、化学性质稳定等特点,被广泛应用于化妆品、电子产品、药物载体、医药和食品包装材料。随着人们与纳米氧化锌接触的日益增多,其对人类健康的潜在毒性影响也引起了高度关注。研究纳米材料对细胞毒性的众多试验中,二维(2D)单层细胞培养仍然是占主导地位的体外模型。在传统2D塑料培养皿中培养的细胞会失去其原有的组织结构,极性以及蛋白质 蛋白质相互作用,而且相比体内模型往往会改变细胞的代谢、表型以及基因表达。当二维细胞培养模型扩展到纳米毒理学研究,它的这些限制有可能导致获得误导性结果和结论的风险。实际上在体内的所有细胞都生长在一个三维(3D)环境中,单个细胞的表型和功能是高度依赖于三维组织-细胞外基质(ECM)蛋白和邻近细胞的复杂相互作用。因此,在一个高度模拟体内生理环境的体外3D模型中进行纳米粒子的毒性研究可以为纳米材料的生物安全性评价提供更多理论基础和参考价值。为了评估不同粒径的纳米氧化锌在2D和3D培养模型中对人结肠癌上皮(Caco-2)细胞的毒性作用,首先通过透射电镜和纳米粒度仪对纳米氧化锌粒子的形状、粒径大小和分布进行表征。在2D和3D培养条件下,利用倒置显微镜观察纳米氧化锌染毒Caco-2细胞对其形态的影响,采用MTT比色法检测细胞活性,对细胞内ROS水平,炎症因子白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-1β(IL-1β)进行检测,通过荧光显微镜观察AO/EB双染后的2D细胞死亡形态,同时借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式。试验结果如下:(1)三种纳米氧化锌样品的平均粒径为24.53±8.54 nm,56.18±9.56 nm,87.26±13.47 nm。(2)纳米氧化锌引起2D细胞形态发生明显变化,而没有引起3D细胞形态发生明显变化。24 nm纳米氧化锌对2D细胞的毒性最大,56 nm纳米氧化锌略低,87 nm纳米氧化锌则最小。三种纳米氧化锌的3D细胞活力差异没有显著性,表明纳米氧化锌的粒径大小对3D细胞的毒性影响没有明显差异。3D细胞活性明显高于2D细胞,表明纳米氧化锌对2D细胞毒性明显高于3D细胞。(3)3D细胞相比2D细胞具有更高的基础ROS水平。2D细胞的ROS水平呈依赖剂量的方式增加,而3D细胞内ROS水平没有显著增加。24 nm纳米氧化锌诱导2D细胞氧化应激程度最高,56 nm纳米氧化锌略低,87 nm纳米氧化锌则最低,而粒径大小对3D细胞内氧化应激程度的影响没有明显差异。高浓度纳米氧化锌(≥75μg/mL)染毒12 h后诱导2D细胞氧化应激程度高于3D细胞。相比2D细胞,纳米氧化锌诱导了3D细胞强烈的炎症反应。3D细胞的炎症因子表达量呈剂量依赖方式增加,24 nm纳米氧化锌诱导炎症反应最强烈。24 nm和56 nm纳米氧化锌诱导2D细胞炎症反应的结果相似,而87 nm纳米氧化锌相对较低。在3D培养条件下,纳米氧化锌诱导的炎症反应与ROS水平无关。(4)在2D培养条件下浓度为75μg/mL的24 nm纳米氧化锌引起的晚期凋亡细胞和坏死细胞数量最多。在两种细胞培养条件下24 nm纳米氧化锌引起Caco-2细胞死亡数量都以剂量依赖方式增加。3D细胞相比2D细胞对24 nm纳米氧化锌的毒性响应明显较低。2D培养条件下坏死成为细胞死亡的主要方式,而3D培养条件下细胞凋亡成为主要死亡方式。
【关键词】：纳米氧化锌 Caco-2细胞 三维 细胞毒性 炎症反应 细胞死亡
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114;TB383.1
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 绪论15-26
• 1.1 引言15
• 1.2 纳米材料的应用15-17
• 1.2.1 纳米技术15-16
• 1.2.2 纳米材料产品16
• 1.2.3 纳米氧化锌的应用16-17
• 1.3 纳米氧化锌的毒理学研究进展17-20
• 1.3.1 纳米氧化锌对细胞的影响17-19
• 1.3.2 纳米氧化锌对动物的作用19
• 1.3.3 纳米材料在体内和体外细胞模型中的毒性作用比较19-20
• 1.4 纳米氧化锌的毒性作用机制20-22
• 1.4.1 活性氧自由基的产生20-21
• 1.4.2 锌离子的释放21-22
• 1.5 三维（3D）细胞培养的研究背景和进展22-25
• 1.5.1 3D细胞培养的研究背景22
• 1.5.2 3D细胞培养的优点22-23
• 1.5.3 3D细胞培养模型的建立23-24
• 1.5.4 Caco-23D细胞培养模型的建立24-25
• 1.6 本课题的研究内容及意义25-26
• 2 纳米氧化锌的表征26-31
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-27
• 2.3 方法27
• 2.4 结果27-29
• 2.4.1 纳米氧化锌样品的粒径形态27
• 2.4.2 纳米氧化锌样品的粒径分布27-28
• 2.4.3 纳米氧化锌样品的平均粒径28-29
• 2.5 讨论29-31
• 3 纳米氧化锌对Caco-2细胞的毒性作用31-39
• 3.1 前言31
• 3.2 材料31-32
• 3.2.1 细胞株31
• 3.2.2 主要试剂31-32
• 3.2.3 主要仪器32
• 3.3 方法32-34
• 3.3.1 细胞培养32-33
• 3.3.2 细胞染毒处理33
• 3.3.3 细胞形态学观察33
• 3.3.4 细胞活性检测33-34
• 3.3.5 数据处理34
• 3.4 结果34-37
• 3.4.1 细胞形态学观察34-35
• 3.4.2 细胞活性检测结果35-37
• 3.5 讨论37-39
• 4 纳米氧化锌引起Caco-2细胞氧化应激和炎症反应的研究39-50
• 4.1 前言39
• 4.2 材料39-40
• 4.2.1 细胞株39-40
• 4.2.2 主要试剂40
• 4.2.3 主要仪器40
• 4.3 方法40-41
• 4.3.1 细胞染毒处理40
• 4.3.2 Caco-2 细胞内活性氧（ROS）的测定40
• 4.3.3 炎症因子表达的测定40-41
• 4.3.4 数据处理41
• 4.4 结果41-48
• 4.4.1 ROS水平检测结果41-43
• 4.4.2 炎症因子IL-8的表达43-45
• 4.4.3 炎症因子IL-1β的表达45-48
• 4.5 讨论48-50
• 5 纳米氧化锌引起Caco-2 细胞死亡的研究50-57
• 5.1 前言50-51
• 5.2 材料51
• 5.2.1 细胞株51
• 5.2.2 主要试剂51
• 5.2.3 主要仪器51
• 5.3 方法51-52
• 5.3.1 细胞染毒处理51
• 5.3.2 AO/EB双染51
• 5.3.3 细胞死亡方式的测定51-52
• 5.3.4 数据处理52
• 5.4 结果52-55
• 5.4.1 AO/EB双染结果52-53
• 5.4.2 细胞死亡方式的测定结果53-55
• 5.5 讨论55-57
• 6 结论57-60
• 6.1 研究总结57-59
• 6.2 课题展望59-60
• 参考文献60-67
• 作者简历67

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