实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究

发布时间：2017-09-24 19:34

  本文关键词：实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究

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【摘要】：当今社会,由食源性致病菌引起的食物中毒情况依旧十分严峻,对全世界尤其是发展中国家的食品卫生安全造成巨大的威胁。在世界范围内,沙门氏菌和副溶血性弧菌是最为常见的两种引起食物中毒的致病菌,而霍乱弧菌则时常引起霍乱的暴发流行,严重威胁着人们的生命财产安全。因此,建立相应的快速检测手段至关重要。目前,各类免疫、分子相关的快速检测技术逐渐趋于完善和成熟,但它们普遍存在需要专业人员、价格昂贵等缺点,并且不能区分食品中存在的活菌与死菌,这势必加大检测结果假阳性的可能性,造成不必要的恐慌和资源浪费。针对上述难题,本论文建立可视化PMA-LAMP快速检测技术来检测这三种食源性致病菌活菌,一方面解决LAMP技术存在的两个方法学基础问题,一方面为食品安全的诊断防治提供新思路和技术平支持。本研究根据霍乱弧菌thy A基因(Gen Bank登录号:AY143429.1)、副溶血性弧菌tox R基因(Gen Bank登录号:GQ228073.1)、沙门氏菌inv A基因(Gen Bank登录号:M90846.1)、沙门氏菌fim Y基因(Gen Bank登录号:JQ665438.1)的相关序列,分别设计LAMP和荧光定量PCR引物,并构建标准质粒。经过优化,确定可视化LAMP反应的体系如下:20 m M Tris-HCl(p H 8.8),10 m M KCl,8 m M Mg SO4,10 m M(NH4)2SO4,0.1%Tween 20,0.8 M甜菜碱(Betaine),d NTPs各1.4 m M,0.4μM F3/B3,3.2μM FIP/BIP,1.6μM LF/LB,0.3 M钙黄绿素(Calcein),0.5 M Mn Cl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μL DNA模板。由于钙黄绿素的荧光特性和SYBR Green I相近,因此反应结果分别可以从荧光曲线和颜色变化两个方面进行鉴定,前者是实时半定量分析,后者是肉眼直接观察的定性分析。特异性试验和灵敏度试验结果显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的LAMP引物特异性良好,检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×101CFU/m L、6.3×102-6.3×103 CFU/m L。q PCR结果和LAMP结果一致。对于PMA的处理条件,确定暗室孵育时间为5 min,LED灯曝光时间为30min,然后对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的PMA处理浓度及待处理的最高死菌浓度进行优化,得到PMA浓度分别为15μM、20μM和5μM,并且,PMA能高效处理最多105 CFU/m L浓度的死菌。将优化好的PMA处理步骤结合可视化LAMP,建立可视化PMA-LAMP,并与PMA-q PCR进行对照。在灵敏度试验中,将梯度稀释的活菌分别添加到105 CFU/m L的死菌基质中,制成死活菌混合液,所得霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×102 CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,与PMA-q PCR结果吻合;在模拟食样试验中,按照上述死活菌混合液制备方法制备菌液,然后人工污染干净的鳕鱼或鸡蛋样品。数据显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌可视化PMA-LAMP检出限则依次为1.7×102 CFU/m L、1.9×102CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,结果与PMA-q PCR一致。在实际样品检测中,从市场上随机购得海产品、蛋类、蔬菜等新鲜样品,经过适当时间的前增菌步骤后,分用可视化PMA-LAMP方法、PMA-q PCR方法和行业标准或国家标准提供的检测方法进行检测,结果显示,霍乱弧菌的检出率依次为2.5%、2.5%和0%,副溶血性弧菌的检出率依次为23.6%、20.8%和20.8%,沙门氏菌的检出率依次为0%、0%和0%。由此可见,可视化PMA-LAMP方法检测时间短,加上至少6h的前增菌,最快只需要8 h不到的时间,且在仪器条件缺乏的情况下,可采取定性分析的方法来进行初筛,提高后续鉴定的效率。本研究将可视化LAMP技术与PMA染料结合,建立霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP快速检测方法,不仅保留可视化LAMP快速简便、高特异性、高灵敏度、适合现场操作等优势,兼顾PMA染料低毒性和高特异性抑制死菌扩增等特点,并且对LAMP方法的荧光半定量检测做了一系列初探工作,在配备荧光定量PCR仪的条件允许下,可无需依赖新的仪器设备,对待测样品进行实时分析。该方法为检测食品中的活的致病微生物搭建了新的技术平台,为尤其是偏远落后地区的食品卫生安全提供新的检测思路。
【关键词】：LAMP 可视化 实时 快速检测 PMA 食源性致病菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 沙门氏菌
【学位授予单位】：中国计量学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-21
• 缩略词汇总21-22
• 1 绪论22-40
• 1.1 霍乱弧菌22-26
• 1.1.1 霍乱弧菌分类22-23
• 1.1.2 霍乱弧菌的生物学特性23
• 1.1.3 霍乱弧菌的毒理作用和主要毒力因子23-24
• 1.1.4 霍乱弧菌流行病学24
• 1.1.5 霍乱弧菌检测方法研究进展24-26
• 1.1.5.1 常规检测方法24-25
• 1.1.5.2 免疫学方法25
• 1.1.5.3 分子生物学方法25-26
• 1.2 副溶血性弧菌26-29
• 1.2.1 副溶血性弧菌生物学特性26
• 1.2.2 副溶血性弧菌的致病机理及相关基因26-27
• 1.2.3 副溶血性弧菌流行病学27-28
• 1.2.4 副溶血性弧菌检测方法现阶段研究进展28-29
• 1.2.4.1 常规生化方法28
• 1.2.4.2 免疫学方法28
• 1.2.4.3 分子生物学方法28-29
• 1.3 沙门氏菌29-32
• 1.3.1 沙门氏菌分类29
• 1.3.2 沙门氏菌生物学特性29
• 1.3.3 沙门氏菌毒力因子29-30
• 1.3.4 沙门氏菌流行病学30
• 1.3.5 沙门氏菌检测方法研究进展30-32
• 1.3.5.1 常规生化方法30-31
• 1.3.5.2 免疫学方法31
• 1.3.5.3 分子生物学方法31-32
• 1.4 环介导等温扩增技术（LAMP）概述32-37
• 1.4.1 LAMP技术介绍32-35
• 1.4.1.1 LAMP的原理32-33
• 1.4.1.2 LAMP引物设计33
• 1.4.1.3 LAMP技术的特点33-35
• 1.4.2 LAMP反应产物鉴定35
• 1.4.3 基于钙黄绿素染料的实时可视化LAMP技术介绍35-36
• 1.4.4 LAMP技术的应用36-37
• 1.5 死活菌检测技术研究进展37-38
• 1.5.1 死活菌检测现状及相关检测方法37-38
• 1.5.1.1 基于RNA水平的检测37
• 1.5.1.2 基于DNA结合染料的检测37-38
• 1.6 本论文研究内容及意义38-40
• 1.6.1 本论文研究内容38-39
• 1.6.2 本论文研究意义39-40
• 2 食品中霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立40-67
• 2.1 实验材料40-43
• 2.1.1 菌株40-41
• 2.1.2 仪器设备41
• 2.1.3 主要试剂41-43
• 2.2 实验方法43-51
• 2.2.1 样本的制备43-44
• 2.2.1.1 细菌培养43
• 2.2.1.2 基因组DNA模板的提取43-44
• 2.2.1.3 相关菌液的制备44
• 2.2.2 LAMP引物和qPCR引物设计44
• 2.2.3 目的片段的PCR扩增44-46
• 2.2.4 PCR产物回收及纯化46-47
• 2.2.5 标准质粒构建47-48
• 2.2.5.1 回收纯化的PCR产物与载体连接47
• 2.2.5.2 转化47
• 2.2.5.3 菌液PCR初步鉴定47
• 2.2.5.4 重组质粒测序与同源性比对分析47-48
• 2.2.5.5 重组质粒提取48
• 2.2.6 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立48-49
• 2.2.6.1 qPCR反应体系的建立48-49
• 2.2.6.2 可视化LAMP反应体系的建立49
• 2.2.7 可视化LAMP反应体系的优化49-50
• 2.2.8 可视化LAMP体系特异性实验及与qPCR体系的比较50
• 2.2.9 可视化LAMP体系灵敏度及与qPCR体系的比较50
• 2.2.10 PMA处理条件优化50-51
• 2.2.11 实时可视化PMA-LAMP体系的灵敏度及与PMA-qPCR体系的比较3051
• 2.2.12 模拟食样实时可视化PMA-LAMP体系与PMA-qPCR体系灵敏度的比较51
• 2.2.13 实际样品检测51
• 2.3 结果与分析51-65
• 2.3.1 标准质粒构建与鉴定51-53
• 2.3.1.1 目的片段电泳鉴定51-52
• 2.3.1.2 标准质粒测序鉴定52-53
• 2.3.2 霍乱弧菌可视化LAMP体系优化和建立53-56
• 2.3.2.1 Mg~(2+)终浓度优化53
• 2.3.2.2 甜菜碱终浓度优化53-54
• 2.3.2.3 内外引物浓度比优化54
• 2.3.2.4 钙黄绿素终浓度优化54-55
• 2.3.2.5 Mn~(2+)终浓度优化55-56
• 2.3.3 霍乱弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较56
• 2.3.4 霍乱弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较56-59
• 2.3.5 PMA浓度优化59-60
• 2.3.5.1 PMA浓度范围初步确定59
• 2.3.5.2 PMA工作浓度优化59-60
• 2.3.6 基质中细胞浓度对PMA处理效果的影响60-62
• 2.3.7 霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较62
• 2.3.8 模拟食样中霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较62-65
• 2.3.9 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用65
• 2.4 小结65-67
• 3 食品中副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立67-83
• 3.1 材料与方法67-71
• 3.1.1 实验材料67-69
• 3.1.1.1 菌种67-68
• 3.1.1.2 仪器设备68
• 3.1.1.3 主要试剂68-69
• 3.1.2 实验方法69-71
• 3.1.2.1 样本的制备69
• 3.1.2.2 副溶血性弧菌LAMP引物和qPCR引物设计69
• 3.1.2.3 副溶血性弧菌标准质粒的制备69-70
• 3.1.2.4 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立70
• 3.1.2.5 实时可视化LAMP和qPCR特异性和灵敏度分析70
• 3.1.2.6 PMA浓度优化70-71
• 3.1.2.7 培养基对PMA处理效果的影响71
• 3.1.2.8 PMA处理上限71
• 3.1.2.9 实时可视化PMA-LAMP的灵敏度及与PMA-qPCR的比较71
• 3.1.2.10 实时可视化PMA-LAMP与PMA-qPCR方法模拟食样实验71
• 3.1.2.11 实际样品检测71
• 3.2 结果与分析71-81
• 3.2.1 标准质粒构建与鉴定72-73
• 3.2.1.1 目的片段电泳鉴定72
• 3.2.1.2 标准质粒测序鉴定72-73
• 3.2.2 副溶血性弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较73
• 3.2.3 副溶血性弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较73-76
• 3.2.4 PMA处理条件优化76-78
• 3.2.4.1 PMA浓度优化76-77
• 3.2.4.2 PMA处理菌液浓度上限77
• 3.2.4.3 不同培养基对PMA处理效果的影响77-78
• 3.2.5 副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较78
• 3.2.6 模拟食样中副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较78-80
• 3.2.7 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用80-81
• 3.3 小结81-83
• 4 食品中沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立83-98
• 4.1 材料与方法83-87
• 4.1.1 实验材料83-84
• 4.1.1.1 菌种83
• 4.1.1.2 仪器设备83-84
• 4.1.2 实验方法84-87
• 4.1.2.1 样本的制备84
• 4.1.2.2 沙门氏菌LAMP引物和qPCR引物设计84-85
• 4.1.2.3 沙门氏菌标准质粒的制备85
• 4.1.2.4 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立85-86
• 4.1.2.5 实时可视化LAMP和qPCR特异性和灵敏度分析86
• 4.1.2.6 PMA浓度优化86
• 4.1.2.7 细菌浓度对PMA处理效果的影响86
• 4.1.2.8 实时可视化PMA-LAMP的灵敏度及与PMA-qPCR的比较86
• 4.1.2.9 实时可视化PMA-LAMP与PMA-qPCR方法模拟食样实验86-87
• 4.1.2.10 实际样品检测87
• 4.2 结果与分析87-96
• 4.2.1 标准质粒构建与鉴定87-88
• 4.2.1.1 目的片段电泳鉴定87
• 4.2.1.2 标准质粒测序鉴定87-88
• 4.2.2 沙门氏菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较88-89
• 4.2.3 沙门氏菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较89-90
• 4.2.4 PMA处理条件优化90-93
• 4.2.4.1 PMA浓度优化90-92
• 4.2.4.2 PMA处理菌液浓度上限92-93
• 4.2.5 沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较93-94
• 4.2.6 模拟食样中沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较94-95
• 4.2.7 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用95-96
• 4.3 小结96-98
• 5 讨论98-100
• 5.1 LAMP引物设计98
• 5.2 实时LAMP的初步探索98
• 5.3 样品的前增菌和稀释98-99
• 5.4 基因组DNA提取99
• 5.5 钙黄绿素染料的注意事项99-100
• 6 总结、创新与展望100-102
• 6.1 总结100-101
• 6.2 创新点101
• 6.3 展望101-102
• 参考文献102-110
• 作者简历110-111

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本文编号：913096