六价铬暴露与p16基因启动子区DNA甲基化之间关系的研究

发布时间：2017-10-06 01:04

  本文关键词：六价铬暴露与p16基因启动子区DNA甲基化之间关系的研究

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【摘要】：目的 本研究的目的是将人群调查和体外细胞培养实验结合,研究六价铬暴露对p16基因启动子区DNA甲基化状态的影响,并明确p16基因DNA甲基化在调控p16基因及蛋白表达中的可能作用及其在六价铬诱发细胞周期阻滞中的作用,从而为六价铬毒性机制的研究提供依据。 方法 在人群调查中,选取某电镀厂工人192例作为六价铬暴露组,对照组80例选自不同电镀企业且与暴露组年龄、性别、吸烟史、饮酒史等条件相近的后勤及管理人员,近3个月内无接触有毒有害化学物质和电离辐射史。采集两组人群肝素抗凝外周血后,用电感耦合等离子体质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)检测血铬浓度,从全血中提取基因组DNA,用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)测定P16基因启动子区DNA甲基化状态,用酶联免疫法测定两组人群血浆中8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)及p16蛋白的含量。按照工龄将六价铬暴露人群分为长期(36个月)和短期暴露组(≤36个月),用x2检验分析接触时间对p16甲基化是否有影响。并分析各氧化应激指标与p16甲基化之间的相关性。 在体外实验中,用0,5,10,15μM的K2Cr207和0,1.25,2.5,5μg/cm2的PbCrO4分别处理人B淋巴母细胞系和肺A549细胞系,K2Cr2O7和PbCrO4的染毒时间分别为2h,24h与4h,24h。染毒结束后收集细胞,使用(Propidium Iodide, PI)荧光染料结合流式细胞仪技术检测细胞周期。提取细胞中的DNA、总RNA及蛋白质,用甲基化DNA定量检测试剂盒检测总的DNA甲基化率,用MSP法和焦磷酸测序法测定P16基因启动子区的DNA甲基化状态,用实时荧光定量PCR技术检测CDK4、CDK6及p16基因mRNA的表达水平,用Western Blot技术检测p16蛋白的表达水平。 结果 六价铬暴露人群血铬显著高于对照人群(p0.01)；暴露人群外周血DNA中p16基因启动子区DNA甲基化率显著高于对照人群(p0.000)；两组人群血浆中p16蛋白的表达水平无显著差异(p0.05)。六价铬暴露人群中,暴露时间对p16基因的甲基化改变无显著影响(x2=1.36,p0.05),而血浆三个氧化应激指标只有GSH的含量与p16甲基化间存在一定的负相关(r=-0.156,p0.05)。 K2Cr2O7和PbCrO4短期(2h/4h)处理对两种细胞的细胞周期无明显影响。重铬酸钾和铬酸铅处理24h后,人B淋巴母细胞系各处理组G1期细胞数均显著高于对照组(p0.01),S期细胞数明显低于对照组(p0.05,p0.01),G2期细胞数均没有显著改变。A549细胞中、高剂量组发生G1期阻滞及G2/M期细胞数的降低,但S期细胞数没有改变。 K2Cr2O7和PbCrO4处理均可降低两种细胞系基因组DNA的总甲基化(5-mC%)水平,且呈一定的剂量效应关系。在人B淋巴母细胞系中,2h/4h处理组DNA总甲基化水平的降低程度比24h处理组更明显。MSP和焦磷酸测序结果均显示两种细胞系p16基因启动子区都处于超甲基化状态,且重铬酸钾和铬酸铅处理对其DNA甲基化状态无明显影响。 两种细胞系经K2Cr2O7和PbCrO4分别处理2h和4h后,p16、CDK4和CDK6基因的表达水平无明显改变。经5-15μM的K2Cr2O7及2.5-5μg/cm2的PbCrO4处理24h后,A549细胞系p16基因的mRNA表达水平显著高于对照组(p0.01), CDK4和CDK6基因的mRNA表达水平显著低于对照组相(p0.05,p0.01)。重铬酸钾和铬酸铅处理24h对人B淋巴母细胞系p16、CDK4和CDK6基因表达水平的影响与A549细胞类似,但PbCrO4处理24h后,人B淋巴母细胞系CDK4基因表达未改变,p16基因mRNA表达升高亦仅出现在1.25μg/cm2处理组。高浓度重铬酸钾和铬酸铅处理24h可致两种细胞系p16蛋白表达水平升高,人B淋巴母细胞系15μM K2Cr207处理组及A549细胞系5.0μg/cm2PbCrO4处理组,p16蛋白表达水平均显著高于对照组(p0.05)。 结论 职业接触六价铬可致暴露人群p16基因启动子区DNA甲基化率高于对照人群、血浆GSH含量低于对照人群,但两组人群p16蛋白表达无显著差异,GSH含量与p16基因DNA甲基化之间呈负相关。可溶性和不溶性六价铬化合物均可致人B淋巴母细胞系和A549细胞系发生G1期细胞周期阻滞,且其可能和p16基因表达上调、CDK4/6基因表达下调及DNA总甲基化水平降低有关,但六价铬化合物对两种细胞系p16基因的上调作用并非通过DNA甲基化途径实现。
【关键词】：重铬酸钾 铬酸铅 六价铬 DNA甲基化 细胞周期 基因表达 p16基因
【学位授予单位】：浙江省医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-19
• 材料与方法19-31
• 结果与分析31-49
• 1. 人群调查31-34
• 1.1 暴露和对照人群血铬比较31
• 1.2 暴露和对照人群P16基因启动子区DNA甲基化率比较31
• 1.3 暴露和对照人群血浆P16蛋白表达水平比较31-32
• 1.4 暴露和对照人群血浆8-OHDG、MDA、GSH水平比较32-33
• 1.5 氧化应激和P16基因DNA甲基化之间相关性分析33
• 1.6 工龄对P16基因启动子区DNA甲基化的影响33-34
• 2. 体外实验34-49
• 2.1 六价铬对两种细胞系细胞周期的影响34-38
• 2.2 六价铬诱导的DNA总甲基化水平改变38-39
• 2.3 六价铬对P16基因启动子区DNA甲基化的影响39-42
• 2.4 六价铬对P16基因表达的影响42-44
• 2.5 六价铬下调CDK4基因表达44-45
• 2.6 六价铬下调CDK6基因表达45-47
• 2.7 六价铬对P16蛋白表达水平的影响47-49
• 讨论与建议49-52
• 结论52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-59
• 综述59-65
• 参考文献63-65
• 附件1 (攻读学位期间发表论文目录)65-66
• 附件2 (攻读学位期间参加的项目及会议)66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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3 Pooja Malhotra;Rakesh Kochhar;Kim Vaiphei;Jai Dev Wig;Safrun Mahmood;;Aberrant promoter methylation of p16 in colorectal adenocarcinoma in North Indian patients[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2010年07期

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本文编号：979825