下调TRF2基因对肿瘤细胞的放射增敏作用及其机制的初步探讨

发布时间：2018-01-23 05:14

本文关键词： 放射敏感/抗拒模型 TRF2 放射敏感性 RNAi干扰 TRF2 放射敏感性端粒酶活性端粒长度　出处：《武汉大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：通过X射线反复辐射端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549和端粒酶阴性的人骨肉瘤细胞株U20S,筛选出具有辐射耐受的细胞株A549R和U20SR,建立具有放射敏感性差异的对比模型,为研究放射敏感性提供具有相同起源和相似遗传背景的细胞模型。通过比较放射敏感株与抗拒株间端粒重复序列结合因子2(Telomere Repeat Sequences Factor2, TRF2)的表达水平的差异,为研究RNA干扰TRF2对肿瘤细胞放射敏感性的影响奠定理论依据。方法：将指数生长期的A549细胞和U20S细胞用6Mv的X线在室温条件下按照单次200cGy的剂量进行照射(射野35cmx35cm,源皮距100cm,X线治疗机),重复照射32次。照射完毕后,将细胞传代达到稳定,采用克隆形成实验进行放射敏感性测定。具有放射抗拒性的A549R细胞系和U2OSR细胞系筛选完成后,采用RT-PCR和Western blot分别检测TRF2在放射敏感／抗拒模型A549/A549R和U2OS/U2OSR中的基因和蛋白表达水平。结果：经过64GyX线照射后,A549细胞和U20S细胞的放射抗拒性增加,差异具有统计学意义(P0.05)。其中,A549的D0=2.911±0.019, SF2=0.6254±0.041, A549R的D0=4.316±0.008, SF2=0.7813±0.014；U2OS的Do=2.851±0.012,SF2=0.54590.009,U20SR的Do=3.846±0.007,SF2=0.7081±0.013。RT-PCR和Western blot结果显示,TRF2在放射抗拒株A549R和U2OSR中的基因和蛋白表达水平均比放射敏感株A549和U20S增高(P0.05)。结论：肿瘤细胞的放射敏感性经重复的6MvX射线照射后明显降低,并在传代过程中持续存在。64Gy的X线照射联合传代培养可以成功筛选放射抗拒株,构建具有相同组织来源和相似遗传背景的放射敏感／抗拒模型,为研究端粒结合蛋白TRF2与肿瘤细胞放射敏感性的关系提供了良好的模型。放射抗拒株TRF2基因和蛋白表达水平的升高,为进一步研究RNA干扰TRF2基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响奠定了理论基础。目的：通过构建FAM-TRF2-siRNA干扰序列,并转染至端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549和端粒酶阴性的人骨肉瘤细胞U20S中,联合不同剂量X射线照射,观察处理后肿瘤细胞放射敏感性变化,从而研究TRF2基因在放射增敏中的作用。方法：根据TRF2mRNA编码序列设计针对TRF2的特异性siRNA干扰序列,通过脂质体转染至A549和U20S细胞,转染后提取RNA及蛋白,分别通过RT-PCR、Western Blot检测干扰前后TRF2在基因水平及蛋白水平的表达。利用克隆形成实验观察干扰TRF2前后A549和U20S细胞放射敏感性有无变化。通过端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR-ELISA)和QPCR法检测干扰TRF2前后A549和U20S细胞的端粒长度以及A549细胞的端粒酶活性有无变化。通过流式细胞仪检测干扰TRF2前后A549和U20S细胞的细胞周期分布情况。结果：A549和U20S细胞经脂质体转染后,在显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达及细胞病变效应。RT-PCR和Western Blot检测TRF2在A549和U20S中的mRNA表达抑制率为分别为89%和85%,蛋白表达抑制率为分别为75%和48%,这表明FAM-TRF2-siRNA干扰序列可以在一定程度上降低TRF2的基因和蛋白表达水平,获得TRF2蛋白表达缺陷的细胞模型。QPCR法显示,A549组、A549-R组、A549-siTRF2组、A549-siTRF2-R组中反应端粒长度的T/S值分别为2.02±0.08、2.42±0.04、1.57±0.16、1.89±0.138。A549-R组的端粒长度较A549-NC组细胞延长(P0.05),A549-siTRF2组的端粒长度较A549-NC组细胞缩短(P0.05),A549-siTRF2-R的端粒长度较A549-NC组细胞缩短(P0.05),较A549-siTRF2组细胞延长(P0.05),较A549-R组细胞缩短(P0.05)。U20S组、U2OS-R组、U2OS-siTRF2组、U2OS-siTRF2-R组中反应端粒长度的T/S值分别为3.64±0.18、3.00±0.33、2.77±0.12、2.04±0.10。U2OS-R组的端粒长度较U2OS-NC组细胞缩短(P0.05),U2OS-siTRF2组的端粒长度较U2OS-NC组细胞缩短(P0.05),U2OS-siTRF2-R组较U2OS-NC组、U2OS-R组、U2OS-siTRF2组细胞端粒长度均缩短(P0.05)。TRAP-PCR-ELISA法显示：经FAM-TRF2-siRNA序列干扰后,A549细胞端粒酶活性从干扰前的2.35544±0.1003减低为1.6960±±0.3071(P0.05),活性有所降低。流式细胞仪检测A549细胞系和U20S细胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干扰前后的细胞周期结果显示：A549-R组G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低；A549-siTRF2-R的S期细胞比例降低,差异具有统计学意义(P0.05)；与U20S相比,U20S-R, U2OS-siTRF2、U2OS-siTRF-R组G0/G1期细胞降低、S期和G2/M期均增高,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光检测A549细胞系和U20S细胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干扰前后γH2AX的表达,结果显示,A549细胞系和U20S细胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干扰后,γH2AX的表达增多。结论：成功构建了具有干扰肿瘤细胞TRF2mRNA基因的干扰序列FAM-TRF2-siRNA。该序列能抑制TRF2基因和蛋白表达,为进一步分析TRF2影响肿瘤细胞放射敏感性的具体机制提供TRF2表达缺陷模型。FAM-TRF2-siRNA可以显著降低肿瘤细胞放射敏感性,使DNA损伤增加,端粒缩短,影响细胞周期分布,同时端粒酶阳性细胞的端粒酶活性有所降低。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R730.55

【参考文献】