GSP对乙醇损伤后大鼠海马神经元形态的影响及氧自由基的研究
本文选题：海马神经元 切入点：乙醇 出处：《郑州大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：背景与目的:现如今,人们时常“以酒庆功、以酒交友、以酒助兴”。酒其主要成分是乙醇,是一种亲神经的小分子物质,能迅速通过血脑屏障,造成中枢神经系统的直接损伤。海马神经元是中枢神经系统中结构和功能最复杂,最特殊的细胞之一,对乙醇毒性作用敏感性较高,长时间的乙醇暴露,可引起海马神经元结构和功能的改变,从而导致认知能力和记忆能力的降低。本研究主要通过构建不同浓度乙醇及葡萄籽原花青素(GSP)作用下的原代大鼠海马细胞模型,采用激光共聚焦显微镜观察不同时间点的细胞形态学的改变,酶标仪测定SOD活性、MDA及LDH的含量变化,为进一步探究乙醇对神经系统损伤机制和如何减轻乙醇诱导的神经细胞损伤提供理论依据。方法:1、从清洁级(SPF级)的SD大鼠乳鼠(出生24h内)分离海马细胞,培养至第7天,采用SP法进行NSE免疫细胞化学法鉴定细胞纯度,选择生长良好,纯度较高的海马细胞随机分成低剂量、中剂量、高剂量组,在培养液中加入无水乙醇,使其终浓度为0.5g/L、1.5g/L、3.0g/L。对照组则加入等量的PBS溶液,细胞培养箱中分别作用1h、4h、8h、12h、24h;收集细胞上清液备用,培养液洗3遍后换液后加入低、中、高剂量的葡萄籽原花青素,使其终浓度为1mg/L、2.5mg/L、5mg/L,对照组加入等量的PBS溶液,细胞培养箱中分别作用8h、24h。收集细胞上清液备用。2、采用超氧化物歧化酶测定试剂盒(WST-1法)、微量丙二醛测定试剂盒(TBA法)和乳酸脱氢酶测定试剂盒(微量酶标法)分别测定不同时间点不同浓度乙醇和葡萄籽原花青素作用下的细胞上清液中SOD活力、MDA和LDH含量。3、通过激光共聚焦显微镜观察不同时间点、不同浓度乙醇和葡萄籽原花青素作用下海马神经元形态的变化。4、统计分析方法:所得数据均用±s表示,采用SPSS17.0统计软件对数据进行多因素方差分析,LSD法进行两两比较,检验水平α=0.05。结果:1、不同浓度不同时间的乙醇和GSP作用下的海马细胞上清液中SOD活力、MDA、LDH含量与对照组相比,差异有统计学意义(P㩳0.05),低剂量乙醇作用后,SOD、MDA、LDH含量变化不明显,中高剂量乙醇作用后,各时间点SOD活力值明显下降,MDA和LDH释放量则明显升高。作用1h、4h后,SOD活力值不断减少,MDA和LDH含量不断升高,高剂量乙醇作用8h后SOD活性仅为10.67±0.393 U/ml,为最低值;与中剂量相比,8h时间点处的高剂量GSP组的SOD活力升高了1.09±0.987 U/ml。MDA含量浮动最大,降低了0.192±0.002nmol/mL,与8h、24h高剂量乙醇组相比,低GSP组的SOD活力有所升高,MDA含量略降低,与低剂量组相比,8h高剂量GSP组LDH含量变化最为明显,与中剂量乙醇组相比,GSP组的LDH含量差异较为显著。与高剂量乙醇组相比,高GSP组LDH含量变化最大,降低了189.78±1.68 U/L。2、不同时间不同浓度乙醇作用下的原代海马神经细胞经过免疫荧光染色后,对照组细胞胞体形态多呈梭形、三角形或椭圆形,核居中,胞体饱满且边界清晰,发出一个或多个较粗的丝状突起,相互连接形成神经网络,染色较为均匀,0.5g/L乙醇作用不同时间的海马细胞形态无明显变化。1.5g/L乙醇作用4h,胞间丝开始减少,作用8h后,受损的细胞开始分泌神经元粘附分子(NCAM),促使部分细胞开始聚团,随着作用时间加长,细胞密度明显降低,有卫星现象出现,胞间丝断裂,部分消失;3.0g/L乙醇作用1h后,细胞已开始聚团,胞间丝断裂,变短,随着作用时间不断增加,神经胶质细胞增多,海马细胞几乎全部聚团,核变小,蓝染加深,细胞呈短棒状,胞间几乎不见连接,神经网络结构已完全破坏,部分细胞已经死亡。低中高剂量GSP作用后,可见部分胞体界限变得清晰,胞间丝明显变粗,染色加深,连接变稠密,部分胞体接近正常,细胞连接恢复,聚团成簇现象明显减少,可见稀疏的神经网络。结论:1、乙醇作用海马细胞后,上清液中SOD活力值明显降低,MDA和LDH含量明显升高,且呈现剂量依赖性趋势,与作用时间相关。说明乙醇增强了海马细胞氧化应激效应,产生毒性作用。GSP可明显提高乙醇损伤后海马细胞上清液中SOD活力值,降低MDA和LDH的释放与生成,且呈现剂量依赖性趋势,提示GSP有抗氧化和保护海马细胞的作用。2、乙醇可使海马细胞密度降低,胞体损伤,边界模糊,胞间丝变细变短,甚至断裂消失,数量减少,破坏神经网络结构。GSP对海马细胞形态有保护作用,修复受损的海马细胞,高剂量的GSP维持乙醇损伤后海马细胞胞体的正常形态,使胞间丝增多变粗,形成稀疏的神经网络结构。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：D919
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，本文编号：1582903
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