基因治疗在运动医学中的应用

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基因治疗在运动医学中的应用

　　中国运动医学杂志1999年第18卷第3期

吕红斌　王嘉芙

　　关键词：基因治疗　肌肉-骨骼系统损伤后修复　生长因子

　　基因治疗是人类很多疾病治疗的重大变革，为人类战胜疾病，延长寿命，提 供了新的途径。 人类基因治疗领域的发展速度非常迅猛，已由早期针对单基因遗传性疾病的治疗迅速扩展到 治疗获得性疾病，而且基因转移还可用作一种药物的传递系统。运动创伤经常涉及一些愈合 能力十分有限的组织，例如，关节软骨、韧带、半月板、肌腱等。最近研究证明，一些生长 因子和细胞因子在愈合过程中起着重要作用，这些分子有望成为治疗运动创伤的新药，但是 从临床上讲还没有有效的方法能将它们传入体内。发展基因治疗技术可以通过局部的方法将 生物药物传入体内。目前已完成了将标记基因传递到滑膜、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞 、腱细胞和韧带成纤维细胞中的实验研究，为基因治疗最终在运动医学领域中的临床应用奠 定了基础〔1，2〕。

　　1　肌肉-骨骼系统损伤后修复的特点

　　剧烈竞争的体育运动，对肌肉-骨骼系统有特殊的要求，运动中随时存在着受伤的危险性。 关节软骨、半月板、前交叉韧带和腱鞘处于少血管或无血管供应状态，因此，这些组织因外 伤或疾病引起的损害后的愈合能力非常有限。损害不仅可引起急性功能障碍，还可导致继发 性伤残。为了减轻损伤对关节的影响和严重后果，提高这些组织损伤后的愈合能力就成为运 动医学领域中的研究重点。

　　有血管的结缔组织修复有其经典的愈合反应，虽然不同组织各自需要不同。损伤后存在有血 液渗出物，从破损血管中产生有关的血液产物、纤维蛋白凝块形成、纤维蛋白骨架的血管再 生，细胞增殖，细胞外基质合成以及最后修复组织的塑型。从损伤的细胞中释放的生长因子 和细胞因子、血小板、多核白细胞以及淋巴细胞在愈合过程的不同方面起作用，它们是通过 自动分泌或旁路分泌途径参与修复过程的。目前很多类型的结缔组织的特殊愈合过程尚未完 全研究清楚，但是生长因子在损伤愈合中的作用已在动物模型中被证实。在人体肌与骨骼的 无血管组织中，如关节软骨或半月板无血管区，愈合作用在某种程度上可能是由于缺少与修 复相关的细胞因子而被削弱。

　　2　生长因子在肌肉-骨骼系统损伤后愈合中的作用

　　以及临床应用中存在的 问题

　　许多研究证实几种生长因子，包括血小板源生长因子(PDGF)〔3〕、纤维母细胞生长 因子(FGF)〔4〕、上皮生长因子(EGF)〔5〕、转化生长因子－β2(TGF－β 2)〔6〕以及胰岛素样生长因子－1(IGF－1)〔7〕对促进创伤愈合都有潜在 的功能。许多蛋白质性的生长因子能影响组织愈合过程。一些生长因子能刺激与愈合过程相 关的因素，包括细胞移动、细胞增殖、细胞分化和基质合成。如果损伤的组织为有血管的， 损伤部位的血小板释放生长因子迅速开始初步修复，随后，新的生长因子由浸润的炎性细胞 和正常存在于组织中的纤维母细胞和内皮细胞合成。而对于自我修复能力有限的组织，例如 ，关节软骨、前交叉韧带、半月板的无血管区等无血管或血管边沿组织，特定的生长因子缺 乏或不恰当的表达可能损害愈合过程。所以，外源性生长因子应用或增加内源性生长因子的 合成可以启动或提高这些组织的愈合过程。

　　几种生长因子已被试用于关节软骨修复的体内模型，并已获得良好的初步结果。Cuevas等的 一项研究表明，纤维母细胞生长因子(FGF)的长期灌注对兔软骨浅表裂伤有促进愈合反应的 作用〔8〕。最近的一项体内试验发现，在关节软骨的部分缺损表面局部应用包含有 特殊 生长因子的纤维蛋白凝块时，能启动滑膜和缺损软骨的细胞复原过程，并且由于转化生长因 子－β1(TGF－β1)的应用大大加速了这一过程〔9〕。虽然半月板的无血管区不 能再生，但在部分半月板切除术后可看到再塑形的过程。半月板纤维软骨细胞在细胞培养时 有 细胞增殖和基质产生能力。转化生长因子－β1(TGF－β1)在半月板细胞和移植培养中 能刺激纤维软骨细胞增殖和蛋白多糖合成〔10〕。内皮细胞生长因子(ECGF)也能促进 半月板的愈合〔11〕，在狗的体内实验中发现外源性纤维蛋白凝块的存在能改善半月 板无血管区损伤的愈合〔12〕。前交叉韧带中的纤维母细胞对EGF、PDGF和IGF－1也 有反应〔13〕。胰岛素样生长因子－1(IGF－1)还用于肌肉损伤。这些研究成果显示 ，临床应用生长因子促进损伤组织的修复是很有潜力的。

　　然而，临床应用生长因子促进愈合还存在一个主要问题，即缺乏合适的传递系统。因为这些 因子是蛋白质，用传统的用药途径很难将其传到体内。传统的用药途径经常要求频繁地输注 这些生物大分子，而结果往往是不能将它们传递到疾病的特定部位。这种治疗结果不能令人 满意，还常伴有副作用。因此，必需采用特殊方法将生长因子送到损伤的组织中。一种方式 是植入局部使之缓慢释放；而最近发展的DNA重组技术和基因转移技术可将编码了相应的生 长因子的基因转移到靶细胞上，在损伤组织的局部合成生长因子并维持一段时间。

　　3　基因治疗在运动医学中的应用

　　基因治疗在运动医学中的应用尚处于初级阶段，但它是一种很有希望的治疗方法，能提高运 动创伤的临床治疗。基因治疗对启动和加速软骨、半月板、肌腱、韧带的修复特别有用。一 旦合适的生长因子被分离出，损伤的分子学和细胞学机理也清楚了，基因转移技术就能提供 有效的传递系统。传递编码了有治疗潜力的蛋白质的基因有很多优点，如性质稳定，理论上 基因传递仅需很少几次甚至可能一次即可，此外，在特定组织内传递基因或表达基因能降低 在其他器官中的暴露，从而减少副作用。

　　最近对将基因转移到兔韧带、半月板、滑膜和关节软骨的可行性及载体的效率进行了研究。 以家兔膝关节为模型，经活体(ex vivo)和活体内(in vivo)技术已被用于把一些基因转移 至滑膜，经活体的基因转移可导致转移基因的暂时性表达，表达强度至少在6周后才减弱〔14〕。编码了β一半乳糖苷酶的标记基因LacZ通过经活体和活体内两种导入途径被转 移。表达LacZ基因的细胞可通过加入产色素的底物x?gal后的代谢产物的着色来分析。活体 内基因转移时，携带LacZ基因的腺病毒载体被直接注射入组织。兔膝关节的滑膜细胞由关节 内注射被转导〔15〕，基因表达至少持续8周〔16〕。Nita等于1996年比 较了不同载体转移基因至关节滑膜的能力，将载体直接注射入兔膝关节，标记基因为LacZ， 基因转移和表达由x?gal染色和PCR方法来分析。结果证实，腺病毒载体在体外和体内转移 时均有较高的效率，LacZ基因表达至少持续28天，但在体内转移时有炎症反应；单纯性疤疹 病毒载体的体外、体内转移也能较高水平地表达LacZ基因，但是受细胞毒素的限制；逆转录 病 毒载体仅在体外基因转移时有效；脂质体在体外实验时结果不稳定，而当体内关节注射时， 基因表达水平低且只持续几天。故认为目前尚没有理想的载体能在体内将基因转移至滑 膜〔17〕。另有实验证明，，携带LacZ基因的腺病毒载体可通过直接注射使兔髌腱纤 维母细胞被转导〔18〕、鸡长趾屈肌腱的腱细胞被转导〔19〕。

　　在经活体基因转移时，选择编码了新霉素磷酸转移酶的Neor基因与用逆转录病毒的 LacZ基 因共同转移。Neor基因使被转导的细胞有抗新霉素及其它的人工合成类似物G418的特性。 在培养基中加入G418可以选择转导细胞。家兔模型实验中证实标记的基因已能转移到半月板 的纤维软骨细胞中〔1〕，经活体基因转移至兔关节软骨和髌腱也已成功〔14， 18，20〕。

　　不同的实验对基因转移载体的研究常得出有差异的结论，但一般认为，逆转录病毒载体对经 活体基因转移非常有效，而腺病毒载体则用于活体内基因转移时效果好。总之，这些研究结 果提示进一步发展基因治疗技术能改善运动创伤的治疗。

　　4　结语

　　基因治疗从实验室走向临床的发展速度很快，尽管目前尚有许多问题需要解决，一系列的临 床试验已在计划中了。骨骼肌肉系统的许多疾病均能得到很好的基因治疗。基因治疗有望为 运动创伤的愈合提供新的治疗方法，尤其在治疗无血管或少血管的结缔组织(如软骨、肌腱 、半月板、韧带)病损等方面。

　　作者单位:湖南医科大学湘雅医院运动医学科(长沙，410008)

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