LTα-55对核辐射骨髓损伤的保护作用及基于NLRP3炎症小体的机制研究

发布时间：2018-03-31 15:56

本文选题：淋巴毒素α　切入点：核辐射　出处：《第二军医大学》2017年博士论文

【摘要】：一、研究背景和目的美国Genentech公司早在1996年就发现野生型淋巴毒素α(Lymphotoxinα,LTα)对核辐射造成的小鼠骨髓损伤具有保护作用,但由于在随后的临床前动物试验中发现野生型LTα可以引起明显的不良反应,如严重的毛细血管渗漏、低血压和寒战发热等,从而使LTα的应用研究未能深入进行。本课题组在野生型LTα的基础上,最初从降低野生型LTα的毒副作用的角度出发,开发N端缺失27个氨基酸残基的LTα衍生物(LTα-27)用于联合化疗。临床前动物试验表明,LTα-27联合化疗药物能够发挥明显的协同杀伤上皮来源肿瘤的作用,而不会诱导骨髓来源细胞凋亡的发生,反而会保护骨髓来源细胞对抗化疗药物的细胞毒作用。但LTα-27在临床I期阶段仍有70%的受试者出现比较严重的寒战发热,限制了它的进一步开发,然而令人意外的发现是临床I期联合使用LTα-27的化疗病人,其血小板、淋巴细胞和中性粒细胞下降幅度明显低于单独使用化疗药物的患者,即LTα-27显现出明显的骨髓/造血细胞保护作用。进一步的机制研究发现LTα通过与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)和TNFR2结合,启动下游信号通路发挥其生物学作用,其中毒副作用主要与TNFR2结合有关。因此在此研究基础上,通过计算机辅助设计和实验筛选,得到与TNFR1特异性结合,但亲和力适中的淋巴毒素衍生物LTα-55。初步的药效学结果显示:LTα-55在猕猴上能够使血小板和淋巴细胞上升,对抗化疗药物的骨髓损伤作用,在小鼠上能够对抗核辐射骨髓损伤使生存率显著增加。由于环境污染、能源紧缺,核能作为一种高效清洁的能源,在全球被广泛运用。但是,核泄露导致的安全隐患却对人类的生存产生巨大的影响。辐射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制导致的造血功能障碍以及外周血白细胞下降,继而使免疫功能损伤,导致继发性感染。因此,保护和恢复骨髓功能是关系到辐射损伤患者预后的关键因素之一,但目前对核辐射导致的骨髓损伤尚缺乏有效的防护手段和治疗方法。已有的研究表明辐射导致的损伤主要是辐射使骨髓造血细胞,表皮细胞和粘膜上皮细胞等分裂旺盛的细胞死亡,但最近的研究认为辐射也会导致外周成熟的免疫细胞(如巨噬细胞、T细胞和B细胞等)显著减少以及促炎因子大量释放,从而造成损伤细胞修复功能受损,免疫功能抑制。其中,巨噬细胞在机体固有免疫和适应性免疫中起着关键作用,其可以通过调节细胞功能,分泌生长因子和吞噬细胞碎片等方式促进炎症消退和损伤组织的修复。研究发现巨噬细胞是固有免疫系统中响应辐射损伤最早的细胞类型。我们在前期研究中发现LTα-55能够使辐射后小鼠的生存率显著上升,骨髓造血功能提前恢复,并且在进一步体外研究中发现,LTα-55能促进人单核细胞株thp-1分泌il-1β增多。il-1β的分泌增多和NLRP3炎症小体的激活有关。我们进一步采用NLRP3炎症小体相关基因敲除小鼠(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))和人单核细胞株thp-1探讨了NLRP3炎症小体在LTα-55对核辐射小鼠骨髓损伤的保护作用及其可能的机制。二、研究方法体内试验观察了LTα-55对野生型、Nlpr~(3)~(~(-/-))、Asc~(~(-/-))和caspase-1~(-/-)小鼠核辐射骨髓损伤的保护作用。辐射前两天和辐射当天小鼠尾静脉各注射一次250μg/kgLTα-55,9.5gy剂量辐照5分钟后观察小鼠存活情况;9.0gy剂量辐照不同时间后进行血象、骨髓和相关病理(主要脏器)检查。体外实验:在人单核细胞株thp-1细胞中观察LTα-55对核辐射后细胞的增殖、凋亡、焦亡和ros生成的影响。细胞计数检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期的改变、检测细胞凋亡、细胞焦亡以及ros的生成。电镜下观察thp-1细胞中NLRP3炎症小体的激活,reaLTime-pcr检测mrna的表达,westernblot检测蛋白的表达,免疫荧光法检测骨髓和脾脏组织中的相关信号通路分子的定位和表达。三、研究结果(一)LTα-55在在体内能促进野生型C57BL/6小鼠核辐射导致的损伤的恢复1、LTα-55能促进野生型C57BL/6小鼠在9.5gy核辐射后生存率的增加,对照组小鼠从d8天开始出现死亡,死亡集中发生在d8~d9天,至d12天对照组小鼠全部死亡。LTα-55组小鼠,雌性小鼠在d14死亡两只,雄性小鼠d18死亡一只,其余小鼠均存活至观察期结束(d28天)。对体重的监测发现,雄性小鼠在第10天时对照组体重明显低于LTα-55组。2、LTα-55对野生型C57BL/6小鼠核辐射后血象的恢复有促进作用,结果显示LTα-55对辐射小鼠的红系、白系以及血小板的恢复都有促进作用。3、骨髓涂片结果显示LTα-55作用下,9.0gy辐射后的野生型小鼠从第七天开始恢复至第十八天基本恢复正常。而对照组第十八天仍显示骨髓有核细胞细胞增生低下。骨髓病理显示出同样的结果。4、脾脏病理显示LTα-55对野生型C57BL/6小鼠核辐射后脾脏的髓外造血有促进作用。相对于溶媒对照组,LTα-55在辐射后第七天脾脏出现淋巴样增生,第十天出现明显的髓外造血。(二)LTα-55体体外对核辐射导致人单核细胞thp-1损损伤的保护作作用1、LTα-55能促进thp-1细胞的增殖并促进辐照下thp-1细胞的存活,在50μg/mlLTα-55的作用下能显著促进细胞增殖。2、6Gy~(60)Co-γ辐照后thp-1细胞发生g2期阻滞,50μg/mlLTα-55可以帮助细胞在48小时时完全逆转g2期阻滞,恢复正常细胞周期。3、10Gy~(60)Co-γ辐照后thp-1细胞凋亡不明显,50μg/mlLTα-55处理细胞48小时后和对照组相比凋亡率有所降低。4、10Gy~(60)Co-γ的辐照后,随着辐射时间的增加,ros逐渐增加,50μg/ml的LTα-55处理细胞可以降低10Gy~(60)Co-γ的辐照后72h细胞内ros的含量。5、LTα-55能降低辐射后细胞的焦亡比率,LTα-55对辐射后的细胞有保护作用。(三)LTα-55的保护作用和NLRP3炎炎症小体相关1、LTα-55对thp-1细胞中NLRP3炎症小体的影响(1)LTα-55能够增加thp-1细胞中NLRP3、caspase-1、il-1βmrna的表达,高浓度的LTα-55作用24小时,il-18mrna水平也升高,同时也能促进thp-1细胞分泌il-1β。(2)电镜结果显示辐射后LTα-55能够迅速激活thp-1细胞中NLRP3炎症小体,同时细胞辐射后细胞的损伤程度明显轻于溶媒对照组。2、LTα-55对C57BL/6小鼠核辐射损伤的保护作用和NLRP3炎症小体(NLRP3、asc、caspase-1)相关(1)LTα-55对NLRP3炎症小体相关的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核辐射后一般情况和生存率的保护作用不明显,和野生型小鼠相比,基因敲除小鼠生存率显著降低。(2)LTα-55对NLRP3炎症小体相关的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核辐射血象的恢复有一定的促进作用,但该促进作用要明显弱于野生型小鼠。(3)骨髓涂片结果显示LTα-55作用下,9.0gy辐射后的基因敲除小鼠从第14天才开始有恢复的趋势。而对照组在观察终点都未见恢复。骨髓病理显示出同样的结果。骨髓结果显示,LTα-55对NLRP3炎症小体相关的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠的保护作用远远弱于野生型小鼠。(4)脾脏病理显示LTα-55对基因敲除小鼠核辐射后脾脏的髓外造血有一定的促进作用。LTα-55组小鼠在辐射后第14天出现明显的髓外造血,时间要迟于野生小鼠,LTα-55对小鼠的保护作用野生型要强于基因敲除小鼠。(四)LTα-55能能在体内激活nf-κb和NLRP3炎炎症小体1、与对照相比,野生C57BL/6小鼠胸骨免疫荧光结果显示LTα-55激活了nf-κb的p52亚基,同时使NLRP3的表达明显增高。在野生型小鼠脾脏组织的免疫荧光检测也证实LTα-55能上调il-1β表达,该结果与细胞水平的研究结论一致。2、用westernblot检测核辐射和/或LTα-55处理后野生型小鼠和NLRP3~(-/-)小鼠脾脏中NLRP3炎症小体效应因子的表达,结果发现在野生型小鼠中,LTα-55能增加辐射小鼠脾脏中il-1β和il-18的蛋白表达,LTα-55组小鼠在辐射1天和3天后il-1β和il-18分别开始升高,3~5天为高峰,7天仍然明显高于对照,而在NLRP3~(-/-)小鼠脾脏中il-1β和il-18表达水平均很低。(五)LTα-55在在核辐射小鼠脾脏中通过上调BCL-XL抑抑制细胞凋亡亡,促进血小板的生成,从而对机体产生保护作用用westernblot检测核辐射和/或LTα-55处理后小鼠脾脏BCL-XL的蛋白表达,LTα-55能在第七天开始明显增加核辐射小鼠脾脏中BCL-XL的表达,维持至18天,在NLRP3~(-/-)小鼠中BCL-XL的表达也有升高,但是没有野生型小鼠明显,该结果也和血象监测中的血小板监测结果一致。四、结论LTα-55对核辐射导致的损伤有显著的保护作用,该作用与LTα-55激活NLRP3炎症小体,进而减少ROS的释放,抑制细胞凋亡和焦亡有关。LTα-55在体外还能拮抗核辐射的细胞周期阻滞作用,促进细胞增殖。LTα-55激活NF-κB(p52)可能参与了NLRP3炎症小体的激活。LTα-55还能上调Bcl-XL的表达,这除了与LTα-55保护辐射所致的细胞凋亡和焦亡有关外,可能还与血小板的再生,进而机体重新启动免疫有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R818

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