基于蛋合质组学的肺结核靶向造影剂的分子靶标研究

发布时间：2018-04-11 18:20

  本文选题：结核杆菌 + 结核病　； 参考：《复旦大学》2014年博士论文

【摘要】：目的建立结核杆菌急性肺感染的动物模型,探讨小鼠肺结核在感染不同时期的micro-CT(micro-computer tomography)表现及其病理的动态演变。根据对不同感染时期肺组织内结核杆菌和宿主的蛋白质组学的分析结果,筛选特异蛋白质作为分子靶标,为制备肺结核靶向CT造影剂提供理论基础。方法应用结核分枝杆菌H37Rv标准株菌悬液以滴鼻法建立C57BL/6J小鼠急性肺结核模型,同时设SPF级健康对照组。分别在感染第1、4、8、12周后进行micro-CT扫描；经心脏灌流后处死小鼠,取1/4肺组织匀浆进行结核杆菌培养；1/4肺组织匀浆进行蛋白质组学分析,分别用于筛选结核杆菌和宿主的分子标记物；1/4肺组织-80℃冻存用于RT-PCR (Real time polymerase chain reaction)验证；余1/4肺组织进行组织病理学分析。通过已建立的小鼠肺结核模型,探讨感染不同时期的病理改变及其micro-CT动态演变特征(正文第一部分重点阐述)。采用鸟枪法液相色谱串联质谱法(shotgun liquid chromatography-tandem mass spectrometry, shotgun LC-MS/MS)分析肺组织中结核杆菌的特异蛋白质：经质谱分析,搜索结核分支杆菌蛋白质组数据库,得到结核杆菌表达的蛋白质组。对这些蛋白质进行功能学分类分析,选择与结核杆菌生长密切相关的细胞膜或细胞壁蛋白质,作为制备靶向造影剂的潜在分子靶标(正文第二部分重点阐述)。采用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)结合LC-MS/MS技术分析肺结核的差异蛋白质组：将获得4组2DE胶,进行图像差异分析、挖点酶解、质谱鉴定并搜索小鼠和结核杆菌蛋白质组数据库,分析差异蛋白质的表达量在不同感染时间点的变化,筛选用于结核病特异诊断的分子靶标,并进行Western Blot和RT-PCR验证(正文第三部分重点阐述)。结果1. 攻毒40只小鼠,共计死亡9只,肺内未出现阳性病灶者3只,剔除实验组,实际第1、2、3、4组每组实验小鼠数目分别为7只、6只、8只、7只,共28只。2. micro-CT-——病理对照分析：感染1周后,急性感染造成大面积肺泡渗出,micro-CT表现为大片磨玻璃密度影,镜下见肺泡间隔增宽,淋巴细胞浸润为主,散在中性粒细胞、巨噬细胞和类上皮细胞；感染4周后,镜下可见巨噬细胞和泡沫细胞大量聚集,散在类上皮细胞、多核巨细胞和泡沫细胞,micro-CT表现为大小不等斑片样实变,边界不清；感染8周后,实变范围增大,类上皮细胞增多,开始出现多核巨细胞聚集成团,有结核肉芽肿形成趋势；感染12周后,渗出减少、多发孤立的肉芽肿形成,或者病变范围进一步进展。感染1、4、8、12周后肺内结核杆菌培养计数结果分别为(单位：log 100 cfu):6.30±0.02,6.61±0.40, 6.38±0.25,4.52±0.32。3.鸟枪法LC-MS/MS蛋白质组学分析结果：感染4、8、12周的肺结核蛋白质样本鉴定出的蛋白质分别为102,101,90个,共计237个蛋白质(根据病理分析,感染1周时肺内为非特异性渗出,故未计入)。在组间重复表达的有43个,占18.2%,其中3个时间点均存在的蛋白质有11个,感染4周和8周重复鉴定的蛋白质12个,感染8周和12周重复鉴定20个,而感染4周和感染12周仅重复鉴定出2个。重复鉴定出的蛋白质按功能分类,第7类(细胞代谢中间产物)最多；其次是第2类(信号通路蛋白)和第9类(调控蛋白)。选择其中感染8周和感染12周重复表达且为细胞膜蛋白质,近年来备受关注的第9类蛋白质中的结核分支杆菌双因子系统中的MtrB进行重点研究,发现结核杆菌的膜蛋白质MtrB可以成为制备结核靶向造影剂的潜在靶标。4.分析4组2DE胶,感染第1、4、8、12周得到的差异表达的蛋白质胶点数目分别为11个,154个,254个和30个,各组间差异点重叠性分析,在4组间,3组间,和两组间均为差异表达的蛋白质胶点分别为0个,14个和75个。选取了145个表达差异点进行胶内酶解,将MS/MS的结果搜小鼠蛋白质数据库,145个蛋白质点对应了82种准确鉴定的非冗余蛋白质。对82种蛋白质进行蛋白质间相互作用网络图分析得出节点蛋白质有：Alb,Vim,Actb,Fthl, Tnnt3,Ftl,Msn等；结合二维凝胶电泳分析的差异倍数比较并查阅文献,发现铁蛋白H链和L链在感染1周时无差异表达,在感染4、8、12周时均有表达上调,且呈抛物线式上调表达,在感染8周时达到峰值。5.将2DE-MS/MS分析得到的结果,搜结核杆菌蛋白质数据库,鉴定得到评分大于36分的仅7种蛋白质,包括：SYA,CP126,HTPG,Y224,SMC,ACEA。结论1.滴鼻法建立的C57BL/6J小鼠急性感染肺结核动物模型,肺活菌计数,micro-CT和组织病理学结果均表明模型制备成功。2.急性小鼠肺结核模型的肺部micro-CT表现随疾病发展有一定的变化规律：早期大片GGO——大小不等实变灶——大范围实变和较大、边界不清的结节(肉芽肿)——实变进一步发展,或实变有所吸收,仅散在多个小结节。这些征象反映了小鼠肺结核病理改变,可用于监测小鼠肺结核的病程,提示在未来的结核动物实验中可减少小鼠不必要的处死。3.活体组织内初步筛选出结核分支杆菌表达的蛋白质MtrB(Rv3245c)可作为制备CT靶向造影剂的潜在分子靶标,为抗MtrB鼠单克隆抗体制备靶向CT对比剂的制备及动物模型的验证提供研究基础,为早期特异性诊断肺结核方面的研究提供了实验依据。4.宿主表达的差异蛋白质随结核病程的发展而不断改变。差异蛋白质：铁蛋白H链和L链可作为在结核感染过程中起重要作用的巨噬细胞的特异的分子标记,可作为新的结核病诊断的特异标志物,对结核病的有效防治提供了新的研究思路。
[Abstract]:Objective To establish an animal model of mycobacterium tuberculosis acute lung infection , to investigate the micro - computer tomography ( micro - CT ) expression and the dynamic evolution of pulmonary tuberculosis in different periods of infection .
After cardiac perfusion , mice were sacrificed and 1 / 4 lung tissue homogenate was taken for Mycobacterium tuberculosis culture ;
1 / 4 lung tissue homogenate was subjected to proteomic analysis to screen the molecular markers of Mycobacterium tuberculosis and host , respectively ;
1 / 4 lung tissue -80 鈩，

本文编号：1737144