不同方式运动对Ⅱ型糖尿病小鼠骨代谢的影响及分子机制研究

发布时间：2018-05-02 22:20

  本文选题：不同方式运动 + Ⅱ型糖尿病　； 参考：《华东师范大学》2016年博士论文

【摘要】：骨作为机体内的重要器官组织,其在机体内具有保护内部器官、运动、造血、贮存矿物质等重要生物学作用。而11型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)患病后胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗导致的高血糖,使得骨吸收代谢超过骨形成代谢,骨量和骨密度降低,导致骨质疏松甚至骨折的发生。而适宜运动训练作为调控骨代谢的有效方式,研究证实其可显著促进骨形成并抑制骨吸收代谢。但目前有关运动调控T2DM骨代谢的研究主要集中在骨表型上,其分子生物学机制尚不清晰。而G蛋白偶联受体48(G protein coupled-receptor 48, GPR48)作为一膜上七次跨膜受体,其在骨组织代谢中起着重要调控作用。而作为与GPR48具有密切调控关系的TGF-β/BMPs和OPG/RANKL/RANK分子轴及其下游CN/NFAT信号通路是调控骨形成和骨吸收代谢的重要信号通路,而目前生物学和体育领域内有关GPR48通过以上两信号通路调控T2DM骨代谢的相关研究还鲜有报道并且有关不同方式运动通过调控GPR48、TGF-β/BMPs、OPG/RANKL/RANK和CN/NFAT信号通路,进而影响T2DM骨代谢的相关研究亦未见报道。本课题将对T2DM对小鼠骨代谢的影响及其生物学机制以及不同方式运动对T2DM小鼠骨代谢的影响及其生物学机制进行较为系统的研究。目的：探究T2DM对小鼠骨组织表型的影响并从骨形成代谢和骨吸收代谢两方面对T2DM影响小鼠骨代谢的分子生物学机制进行研究；探究不同方式运动对T2DM小鼠骨组织表型的影响并从骨形成代谢和骨吸收代谢两方面对不同方式运动影响T2DM小鼠骨代谢的分子生物学机制进行研究。本研究希望能为运动防治T2DM骨质疏松以及T2DM骨质疏松药物研发提供一定的理论基础和药物靶点。方法：利用高脂膳食并注射链脲佐菌素(STZ)法进行T2DM小鼠造模,并利用游泳(50min/天,6天/周,共8周)和下坡跑(0.8Km/h,50min/次,坡度-9度,6天/周,共8周)对T2DM小鼠进行8周运动训练。结束后,利用电子称对T2DM小鼠体重进行测量；利用游标卡尺和电子称对T2DM小鼠股骨和胫骨的骨形态和湿重进行测量；利用Micro CT软件对左侧小鼠股骨远端进行扫描；利用ALP染液、TRAP染液和茜素红染液对小鼠颅骨分别进行染色；利用石蜡包埋、HE、TRAP和茜素红染色对小鼠右侧股骨切片进行染色；取小鼠BMSCs并利用细胞原代培养诱导其向OB分化,并利用茜素红、ALP和Von Kossa染液对OB进行染色；取小鼠BMSCs并利用细胞原代培养诱导其向脂肪细胞分化并利用油红O染液进行染色；取小鼠BMM并利用细胞原代培养诱导其向OC分化,并利用TRAP染液进行染色；利用RT-PCR技术对小鼠骨、OB和OC中的相关细胞因子mRNA表达进行检测；利用West-blotting技术对小鼠骨中相关蛋白表达进行检测；利用ELISA去对小鼠血清中IP3和Ca2+浓度进行检测。结果：第一章(1)与ZC组相比,TC组体重(P0.01)、胫骨湿重(P0.01)、胫骨远端冠状面宽度(P0.05)、胫骨近端冠状面宽度(P0.05)、股骨湿重(P0.05)、股骨长度(P0.05)、股骨远端矢状而宽度(P0.05)、股骨远端冠状面宽度(P0.01)、股骨松质骨BMD(P0.01)、BV(P0.01)、BV/TV(P0.01)、BS(P0.05)、IS(P0.05)、BS/TV (P0.01)、Tb.Th (P0.01)、Tb.N(P0.01)、BS/BV (P0.01)、Tb.Sp(P0.05)、皮质骨BMD(P0.01)、IS (P0.05)、BS/BV(P0.05)、Tb.Th (P0.05)、Van Gieson和HE染色结果均出现显著性下降。(2)与ZC组相比,TC组颅骨茜素红和ALP染色显著下降,GPR48(P0.01)、TGF-β1(P0.01)、Smad2(P0.05)、Smad3(P0.05)、Smad4(P0.01)、BMP-2(P0.01). BMP-9(P 0.01)、Smad1(P0.05)、Smad5(P0.01)、OC(P0.05)、Osx(P0.01)、Runx2(P0.05)、 OCN(P0.05)、BSP(P0.05)、ALP(P0.01)、Coll(P0.05)和OPN(P0.05)的mRNA表达和GPR48(P0.05)、Smad5 (P0.05)、p-Smad8 (P0.05)、p-Smad2 (P0.01)、 p-Smad3(P0.05)、OPN(P0.05)、p-Smadl(P0.01)、Smad4(P0.05)和Coll(P0.01)的蛋白表达均显著下降,OB的茜素红、ALP和Von Kossa染色结果显著下降,脂肪细胞显著增多,OB中GPR48(P0.05)、ALP(P0.05)、Runx2(P0.05)、Osx(P0.01)、DMP1(P0.05)和SOST(P0.05)的mRNA显著下降。(3)与ZC组相比,TC组股骨和颅骨TRAP染色显著增强、分化产生的OC显著增多、OC中GPR48(P0.05)、TRAP(P0.05)和NFATcl(P0.05)mRNA表达晁著变化,IP3(P0.05)和Ca2+(P0.05)浓度显著升高,GPR48(P0.01)、OPG(P0.01)、RANKL(P0.05)、 RANK(P0.01)、TRAF6 (P0.01)、CN (P0.01)、Src-3 (P0.01)、PLC(P0.01)、 NFATc2(P0.01)、NFATcl(P0.05)、TRAP(P0.01)、C-fos(P0.01)、AP-1 (P0.05)、 CTSK(P0.01)和PU.1(P0.05)的mRNA表达均出现显著变化,RANKL (P0.05). RANK(P0.01)、C-fos(P0.05)、C-Src(P0.01)和TRAF6(P0.01)的蛋白表达亦均出现显著变化。第二章(1)与TC组相比,TS组体重(P0.01)、股骨湿重(P0.01)和HE染色骨小梁数量均出现显著变化,TD组体重(P0.01)、胫骨湿重(P0.05)、胫骨长度(P0.05)、胫骨中间矢状轴宽度(P0.01)、股骨湿重(P0.01)、股骨远端矢状轴宽度(P0.01)、股骨远端冠状轴宽度(P0.01)和股骨中间状轴宽度(P0.05)均出现显著变化,股骨皮质骨BV/V(P0.05)、BS/BV(P0.05)、Tb.Th(P0.05)和松质骨BMD(P0.01)、BV(P0.05)、 BV/V(P0.01)、 BS(P0.05)、IS (P0.05)、BS/BV(P0.01)、BS/TV(P0.01)、 Tb.Th(P0.05)、Tb.N(P0.01)均出现显著增多,Van Gieson和HE染色结果显示,骨小梁数量显著增多。与TS组相比,TD组股骨远端矢状轴宽度(P0.05)、松质骨BS/TV(P0.05)、Van Gieson和HE染色结果显示,骨小梁数量显著增多。(2)与TC组相比,TS组茜素红和ALP结果显著增强,GPR48(P0.01)、TGF-β1(P 0.05)、BMP-9(P0.01).Smad5(P0.05)、OC(P0.05)、Osx(P0.01)、OCN(P0.01)、 ALP(P0.05)和Coll(P0.01)的mRNA表达与GPR48(P0.05)、p-Smad1(P0.05)、 Smad5(P0.05)、p-Smad8(P0.05)、p-Smad2(P0.05)、p-Smad3(P0.05)和OPN(P0.05)的蛋白表达以及OB中GPR48(P0.05)、Osx(P0.01)、ALP(P0.01)和DMP1(P0.05)的mRNA表达均显著上调,OB茜素红、ALP和Von KOSSa染色结果显著增强,脂肪细胞显著减少。TD组茜素红和ALP结果显著增强,骨中GPR48(P0.01)、 TGF-β1(P0.05)、Smad2(P0.05)、BMP-2(P0.05)、BMP-9(P0.01)、Smad1(P0.05)、 Smad5(P0.01)、OC(P0.01)、Osx(P0.01)、Runx2(P0.01)、OCN(P0.01)、ALP(P 0.01)、Coll(P0.01)、OPN(P0.05)和OB中GPR48(P0.05)、Osx(P0.01)、ALP(P0.05)和DMP1(P0.05)的mRNA表达均显著上调,骨中GPR48(P0.01)、Smad1(P 0.05)、p-Smad1(P0.01)、Smad5(P0.01)、p-Slnad8(P0.01)、p-Smad2(P0.05)、 p-Smad3(P0.05)、Smad4(P0.05)和Coll(P0.01)的蛋白表达均显著上调,OB茜素红、ALP和Von Kossa染色结果显著增强,脂肪细胞显著减少。与TS组相比,TD组ALP染色显著增强,骨中Smad2(P0.05)、BMP-4(P0.05)、Smad8(P0.05)、OC(P 0.01)、Osx(P0.05)、ALP(P0.05)、Coll(P0.01)和OB中ALP(P0.05)的mRNA表达均显著上调,骨中p-Smad1(P0.05)、p-Smad8(P0.05)、p-Smad2(P0.05)、 p-Smad3(P0.05)、Smad4(P0.05)和Coll(P0.05)的蛋白表达均显著上调,OB的ALP和Von Kossa染色结果显著升高,脂肪细胞显著减少。(3)与TC组相比,TS组股骨和颅骨TRAP染色显著下降,OC数量减少,OC中GPR48(P0.01)和骨中GPR48(P0.01)、OPG(P0.01)、RANKL(P0.05)、TRAF6(P0.05)、 CN(P0.05)、PLC(P0.01)、NFATc2(P0.05)、TRAP(P0.01)、C-fos (P0.05)、 CTSK(P0.05)和PU.1(P0.05)的mRNA表达均显著变化、Ca2+(P0.05)浓度显著下降,骨中RANKL(P0.05)、C-fos(P0.05)和C-Src(P0.01)蛋白显著下调；TD组股骨和颅骨TRAP染色显著下降,OC数量减少,OC中GPR48(P0.05)、TRAP(P 0.05)、NFATcl(P0.05)、c-Src(P0.05)和骨中GPR48(P0.01)、OPG(P0.01)、RANKL(P0.01)、RANK (P0.01)、TRAF6(P0.01)、CN(P0.05)、Src-3 (P0.01)、PLC (P0.01)、NFATc2(P0.05)、NFATcl(P0.05)、TRAP(P0.01)、C-fos(P0.05)、 AP-1(P0.05)、CTSK(P0.01)和PU.1(P0.05)的mRNA表达均显著变化,IP3(P0.05)和Ca2+(P0.05)浓度均显著下降,骨中GPR48(P0.01)、RANKL(P0.01)、C-fos(P0.01)、C-Src(P0.01)、RANK(P0.01)和TRAF6(P0.01)蛋白表达出现显著变化。与TS组相比,TD组股骨和颅骨TRAP染色显著下降,OC数量减少,OC中GPR48 (P0.05)和骨中OPG (P0.05)、TRAF6 (P0.05)、Src-3 (P0.05)、PLC (P0.01)、 TRAP (P0.05)、C-fos(P0.05)、CTSK(P0.05)和PU.1(P0.05)mRNA均显著变化,1P3(P0.05)和Ca2+(P0.05)浓度均显著下降；骨中GPR48 (P0.05). RANK(P0.01)和TRAF6 (P0.01)蛋白表达显著变化。结论：第一章：(1)T2DM小鼠骨微细结构和骨量显著降低,导致骨质疏松的发生；(2)表达下调的GPR48通过抑制TGF-β/BMPs信号通路进而抑制成骨细胞分化及其成骨能力并促进脂肪细胞分化,降低T2DM小鼠骨形成能力；(3)表达下调的GPR48通过激活OPG/RANKL/RANK及其下游CN/NFAT信号通路,进而促进T2DM小鼠破骨细胞分化,增强T2DM小鼠的骨吸收能力。第二章：(1)下坡跑可显著提高T2DM小鼠骨微细结构和骨量并改善骨质疏松情况,且其作用效果优于游泳运动；(2)下坡跑通过上调GPR48和TGF-p/BMPs信号通路从而促进T2DM小鼠OB分化和成骨能力并抑制脂肪细胞分化,提高骨形成代谢,且其作用效果优于游泳运动；(3)下坡跑通过上调GPR48进而抑制OPG/RANKL/RANK及其下游CN/NFAT信号通路抑制T2DM小鼠OC分化及骨吸收功能,抑制骨吸收代谢,且其作用效果优于游泳运动。本研究为防治T2DM骨质疏松或骨折的发生提供一定的理论依据,为T2DM药物的开发提供新的药物靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R87
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本文编号：1835725