基于新型肿瘤新生血管靶向肽iNGR的肿瘤核素显像研究

发布时间：2018-07-23 16:25

【摘要】：背景:肿瘤特异性分子影像,可以直观地探测到肿瘤高表达的生物标志物,是肿瘤精确诊断、治疗靶点筛选以及治疗疗效监测的重要工具。肿瘤新生血管标志物,已被证明是一种有效的特异的分子成像靶点。CD13是一种膜外肽酶,在肿瘤新生血管内皮和多种肿瘤细胞高表达,是公认的肿瘤诊断和治疗的靶点。包含NGR序列的多肽,是CD13的特异性配体,可作为CD13显像的靶向分子。用放射性核素64Cu、99mTc及68Ga标记NGR探针的显像效率和特异性已经被验证。然而,跟传统的PET显像剂18F-FDG相比,NGR多肽探针的主要局限性在于肿瘤中较低的摄取水平和较短的滞留时间。上述局限性不仅存在于NGR探针,而是小分子多肽探针的共性问题。分析其原因主要有两个方面:首先,多肽探针由于其小分子量和较大的极性,肾脏排泄迅速,导致其血浆半衰期很短,进而在肿瘤的摄取很低。另外,因为多肽探针难以渗透进肿瘤组织深部,只能与新生血管内皮细胞表面有限的cd13位点暂时性结合,导致在肿瘤组织的低摄取和滞留时间很短。cendr序列(r/kxxr/k)是c-末端为精氨酸或赖氨酸残基的c-末端序列,通过与nrp-1相互作用,能够引导多肽穿过血管等生物屏障,提高渗透与滞留能力。sugahara等通过将cendr序列插入另一种肿瘤特异性的血管靶向多肽rgd合成irgd(internalizingrgd,包含cendr序列和rgd序列),结果表明irgd包被的纳米颗粒能特异性地从肿瘤新生血管渗透进肿瘤组织和细胞,从而显著提高了肿瘤显像剂的灵敏度,提供了一种增加抗肿瘤药物有效性的技术手段。随后,该研究团队将他们合成的ingr(internalizingngr,包含cendr序列和ngr序列)偶联到纳米粒子上得到了相似的效应。本研究拟合成插入cendr序列的ingr多肽,通过与nrp-1相互作用介导ngr肽渗透进肿瘤组织,增加ngr探针在肿瘤的摄取和滞留,从而为增强放射性多肽探针对肿瘤的显像效能提供一个新的途径。目的:评价包含ngr靶向序列和cendr(r/kxxr/k)渗透序列的新型分子探针68ga-dota-ingr在cd13表达阳性移植瘤的micropet显像效能,并通过阻断实验阐述nrp-1的作用机制。方法:1、参照sugahara等的研究[1,2],将cendr序列插入ngr,并与dota耦合,之间用ggg相连,构建成前体dota-ingr(dota-gggcrngrgpdc,其中ingr通过cys4和cys12二硫键连接成环),并交由上海吉尔生化有限公司合成,用高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography,hplc)分析其纯度。2、取由68ge/68ga发生器获得的68ga新鲜淋洗液200μl(92.5-129.5mbq),通过调节ph值、反应温度、反应时间及dota-ingr多肽用量,探索最佳标记条件。测定标记产物(68ga-dota-ingr)的体外稳定性、体内稳定性及脂水分配系数。正常小鼠经尾静脉注射68ga-dota-ingr后于10、20、40、60及120min处死,取血及主要脏器,测定重量及放射性计数。3、通过westernblot和细胞免疫荧光鉴定ht-1080和ht-29细胞的cd13和nrp-1受体表达;通过竞争结合实验,比较dota-ingr和dota-cngr(dota-gggcngrc)与cd13受体阳性ht-1080细胞的亲和力;通过细胞结合实验测定68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr在ht-1080和ht-29细胞的摄取率;ht-1080细胞加入68ga-dota-ingr之前与1μg/ml中和nrp-1抗体孵育15min以阻断nrp-1受体行细胞nrp-1阻断实验。4、在裸鼠的两侧肩部分别建立ht-1080和ht-29移植瘤模型。比较68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr在荷瘤裸鼠的micropet显像效能;将68ga-dota-ingr和未标记的cngr(20mg/kg)共注射行竞争micropet/ct显像验证68ga-dota-ingr在体内与cd13结合的能力;通过中和nrp-1抗体(50μg)阻断nrp-1受体行micropet/ct显像验证ingr通过nrp-1介导而提高显像性能的作用机制。肿瘤区勾画感兴趣区(regionsofinterests,roi),用%id/g(percentageofinjecteddosepergramoftissue)表示肿瘤摄取值。结果:1、dota-ingr由吉尔生化有限公司合成,经hplc分析,其纯度95%。2、68ga放射性活度为92.5-129.5mbq时,dota-ingr最少用量2μg,ph4.0,90-100℃加热5-10min,标记率最高,可达97.5±1.3%,放射性比活度约54-75mbq/nmol。68ga-dota-ingr在生理盐水及鼠血清中放置4h后,放射化学纯度均大于95%,在体内代谢1h,尿液68ga-dota-ingr放射化学纯度仍大于85%。脂水分配系数为-2.71±0.18。68ga-dota-ingr在小鼠体内经肾代谢,血液清除迅速,其他脏器放射性摄取少。3、cd13和nrp-1在ht-1080细胞高表达,在ht-29细胞不表达。竞争结合实验中dota-ingr和dota-cngr的ic50值分别为(4.98±1.91)×10-8m和(5.04±1.17)×10-8m,无统计学意义,说明二者具有相同的亲和力;细胞结合实验中,68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr都能与ht-1080细胞结合,而且细胞摄取率随着时间延长而增加。孵育2h,68ga-dota-ingr在ht-1080细胞的最大摄取率是68ga-dota-cngr的近2倍(1.78±0.14%及0.90±0.12%,p0.05)。但是,在cd13表达阴性的ht-29细胞,68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr摄取率很低,孵育2h的摄取率分别为0.38±0.07%和0.26±0.05%(p0.05),明显低于两种探针在HT-1080细胞的摄取(P0.01)。在NRP-1受体阻断实验中,HT-1080与中和NRP-1抗体孵育15 min后,68Ga-DOTA-iNGR 4个时间点的摄取率从0.50±0.08、1.08±0.07、1.54±0.10、1.78±0.14%分别降到0.26±0.09、0.58±0.10、0.86±0.11、0.96+0.12%(P0.05)。而且经中和NRP-1抗体阻断后,68Ga-DOTA-iNGR在HT-1080细胞的摄取率与68Ga-DOTA-cNGR无统计学差异(P0.05)。4、HT-1080和HT-29移植瘤模型行68Ga-DOTA-iNGR或68Ga-DOTA-cNGR microPET显像,结果显示,除了肾脏,与HT-29肿瘤比较,CD13表达阳性的HT-1080肿瘤清晰显影,且HT-1080肿瘤对68Ga-DOTA-iNGR的摄取明显高于68Ga-DOTA-cNGR,3个时间点(注射后0.5、1、1.5 h)两种探针的摄取值分别为3.41±0.28、2.97±0.30、2.64±0.31%ID/g和2.68±0.35、1.91±0.32、1.45±0.30%ID/g(P0.05)。随着时间延长,68Ga-DOTA-iNGR及68Ga-DOTA-cNGR的肿瘤摄取值均有所下降,其0.5 1 h的下降斜率分别为-0.74±0.22及-1.23±0.25,提示68Ga-DOTA-iNGR的肿瘤滞留时间约是68Ga-DOTA-cNGR的1.7倍(P0.05)。在阻断实验中,荷瘤裸鼠经尾静脉共注射68Ga-DOTA-iNGR和未标记的过量的cNGR,HT-1080肿瘤的放射性摄取几乎被完全阻断,肿瘤摄取值从2.92±0.40下降到0.57±0.26%ID/g(P0.01)。而在注射68Ga-DOTA-iNGR前经尾静脉注射中和NRP-1抗体,HT-1080肿瘤的放射性摄取只被部分阻断,肿瘤摄取值从2.96±0.43下降到1.82±0.34%ID/g(P0.05),而且结果显示,被中和NRP-1抗体阻断后,68Ga-DOTA-iNGR在HT-1080肿瘤的聚集程度与68Ga-DOTA-cNGR结果近似(P0.05)。结论:含有CendR基序的68Ga-DOTA-iNGR较传统68Ga-DOTA-cNGR探针具有更高的肿瘤摄取和更好的肿瘤滞留,表明CendR基序修饰有望成为增强肿瘤靶向显像效能的新途径。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.44

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