西藏小型猪急性辐射损伤模型的建立及肠损伤机制的相关研究

发布时间：2018-07-29 07:07

【摘要】：研究背景和目的核恐怖、核污染及医源性核放射治疗对人类健康、安全及生存的影响非常广泛。尤其是近年来核事件如日本福岛核电站泄漏,朝鲜试验杀伤性核武器等引起了人们的广泛关注,如何在这种突发事件中做好应对是各国都非常关心的重点。大型核电站事故或核恐怖事件都会导致短时间内波及大量人员,受害者通常在短时间内受到高剂量辐射后产生全身反应,常伴有全身炎症,恶心呕吐,败血症,皮肤烧伤等症状。由于这些症状的特征不明显,再加上临床工作中,处理受到核辐射损害的患者非常罕见,大部分临床工作人员对这类受害者没有清楚的认识,不能正确及时的诊断病人的伤情并采取积极治疗措施。此外,全球每年有2000万肿瘤患者接受放射治疗,放疗后伴有辐射损伤症状的存活患者约150万。小肠组织的放射毒性仍然是腹部和盆腔肿瘤治疗的主要障碍,限制了高治疗剂量的使用。鉴于此,通过建立西藏小型猪急性辐射损伤模型来进行快速诊断方法和损伤机制的研究,可为临床辐射损伤的保护及救治提供新的思路。 [18F]-FDG-PET/CT(18氟代葡萄糖正电子发射断层扫描术/计算机层析X射线摄影法)是一种先进的分子成像诊断技术。其将先进的分子、功能、代谢成像与经典的解剖、形态、密度显示相互结合,不仅保留了经典解剖影像的作用,还加入了先进分子影像的功能,对于临床诊断具有重要的意义。目前,PET/CT在90%的临床应用主要用于早期发现或排除肿瘤、然而,关于[18F]-FDG-PET/CT在急性放射损伤中的应用报道较少。理论上,机体遭受不同程度的电离辐射后,全身发生炎症反应、甚者细胞凋亡、组织坏死,能量代谢通路会发生不同程度的改变,且这种改变必将导致[18F]-FDG的摄取发生变化。但辐照诱导的这种[18F]-FDG摄取的变化是否具有规律性?能否可用于快速诊断患者受照剂量并反映机体受损程度是本课题解决的问题之一。 PET/CT用于急性辐射病的诊断原理基于急性辐射病的发病机制与葡萄糖代谢异常紧密相关,而葡萄糖代谢是机体能量代谢的重要组成部分。线粒体是小肠能量代谢的结构基础,是细胞有氧氧化合成ATP的部位,同时也是对辐射损伤最敏感的细胞器之一。我们通过对小肠线粒体复合物酶活,呼吸功能,能量物质的含量及荧光定量PCR测定线粒体蛋白编码基因的表达,展示了辐射引起小肠线粒体各指标的变化和相互关系,为能量代谢通路障碍的分子机制提出了进一步的验证。方法第一章西藏小型猪急性辐射病模型的建立选用未去势雄性西藏小型猪为动物模型(n=54),实验组用直线加速器分别予2、5、8、11、14Gy单次剂量照射(n=9/组),剂量率均统一为255cGy/min。对照组9只未予照射。观察西藏小型猪辐射后呕吐、腹泻,大便隐血、外周血淋巴细胞计数及淋巴结淋巴细胞凋亡等指标,分别于照射后6、24、72小时予西藏小型猪分别处死实验组中的三只小型猪,光镜及电镜观察不同剂量不同时间点下西藏小型猪小肠及淋巴结的形态学变化。根据临床现有的辐射病分级标准,比较不同剂量辐射后小型猪的症状与人类急性放射病模型的特点,确定西藏小型猪急性辐射病模型的成功建立。数据分析采用析因法对外周血淋巴细胞计数,淋巴结淋巴细胞凋亡率进行分析。如剂量、时间因素的交互效应及主效应p值小于0.05,则应分别固定时间因素及剂量因素,并用单因素方差分析法对两者的简单效应进行分析。组内多重比较根据方差齐性结果,分别用最小差值法(LSD)或Games-Howell法进行分析。小肠病理评分结果主要采用K-INDEPENDENT Samples非参数检验法进行检测。所有数据处理均用Statistical Product and Service Solutions13.0(SPSS13.0)软件完成。第二章PET/CT在急性辐射病中的应用探索实验动物分组及辐照条件参照第一章,PET/CT扫描方法如下：麻醉后,西藏小型猪静脉注射造影剂一小时后开始扫描。扫描所获图像及数据均通过Xeleris工作站系统进行处理。对FDG摄取的定量主要通过：1)划定目的区域(regions of interest, ROIs),本章目的脏器为小肠。2)通过Xeleris工作站系统自动计算注入的FDG剂量与ROIs之间的比值(%ID)。数据的标准化均由电脑自动完成并以SUV值的形式输出。为使图像更为直观的表现出SUV值的差距,本研究主要应用rainbow伪彩模式并将所生成图片的颜色参照彩图条进行设定。为保证结果的客观真实性,我们做了下列措施：1)注入FDG的量统一以0.11-0.13millicurie/kg/猪进行计算；2)所有的实验用猪在进行PET/CT扫描前,至少禁食8小时保证血糖水平的均一和稳定；3)同时对三个相邻层面的SUV最大值进行扫描收集并用以统计学分析；4)小型猪统一于FDG注射后1小时进行扫描。统计方法如下：数据均以均数±标准差的形式进行表示。用析因分析法对小肠SUV值进行分析。如剂量、时间因素的交互效应及主效应p值小于0.05,则应分别固定时间因素及剂量因素,并用单因素方差分析法对两者的简单效应进行分析。组内多重比较根据方差齐性结果,分别用最小差值法(LSD)或Games-Howell法进行分析。P值小于0.05被视为具有统计学差异(双尾)。第三章急性辐射病的能量代谢损伤机制本实验所用的18只成年雄性西藏小型猪来自第一章动物分组中2,5,8,11,14Gy的72小时组及对照组。对照组3只,实验组每组3只,静脉注射速眠新麻醉(0.05ml/kg)后分别接收2,5,8,11,14Gy单次X线照射。于辐射72小时麻醉处死前,进行各项能量代谢指标的测定。能量代谢的观察指标包括线粒体超微结构观察、线粒体呼吸链酶复合物活力的测定、线粒体呼吸功能的测定、高效液相色谱法测定不同类型辐射病小肠腺苷酸含量、不同类型急性辐射病蛋白质编码基因的测定。统计方法均采用单因素方差分析。单位湿重能量物质与单位DNA能量物质与病理积分的相关性采用Spearman法,统计软件为SPSS13.0。结果第一章西藏小型猪急性辐射病模型的建立西藏小型猪在辐射后24小时,72小时的腹泻,呕吐及大便隐血评分均无统计学差异(P值0.05)。各时间点外周血淋巴细胞计数均随着辐照剂量的增加而降低。与对照组相比,各剂量组之间的差异在72h组最为明显。从形态学来看,各实验组随着剂量的增加,淋巴结的体积缩小,出血明显,淋巴细胞数明显下降。西藏小型猪各剂量组辐射6h淋巴结内每个淋巴小结区域的淋巴细胞数目与对照组无明显差异,但在24h和72h,淋巴结内淋巴细胞的数目随着剂量的升高明显降低,且显示出剂量效应。淋巴结淋巴细胞的凋亡率在各时间点都与对照组有统计学差异(P0.05),2Gy-11Gy之间随着辐射剂量上升,凋亡率也明显上升。72h时,细胞凋亡率在8Gy-14Gy区间内无统计学差异。除了11Gy,同一剂量6h、24h和72h的凋亡率相比,没有统计学差异。各时间点,11Gy组的凋亡率是最高的。辐射后,分别于6小时,24小时和72小时处死不同剂量组的3只西藏小型猪,肉眼观察到不同剂量组各时间点小肠组织变化没有明显差异。照射后6小时即能观察到小肠组织的损伤,但总体来说72小时病变更为明显直接。2Gy组和对照组的小肠组织没有明显不同,5Gy组观察到小肠黏膜面基本平滑,绒毛和皱襞消失,肠壁变薄,小血管扩张、水肿和充血、出血、血淤滞、微血栓、有散在小片状或点状出血。8Gy及11Gy出血多呈斑点状,发生广泛或弥漫性出血,有1只动物观察到肠道大量出血性积聚和血凝块。14Gy组所有动物都出现肠黏膜面大范围的弥漫性出血或肠腔内积血,绒毛上皮发生广泛坏死,黏膜枯萎,肠绒毛裸露。病理结果的半定量积分评估分析,发现病理积分随着剂量的增加明显增加,剂量效应大于时间效应。电镜观察淋巴结细胞的超微结构在11Gy之前组均显示典型的凋亡细胞形态结构。例如,浓缩的染色质及早期染色质边缘集中,中期典型的新月体和环状染色质,细胞质细胞器紧贴,晚期细胞皱缩及凋亡小体。电镜下可见其变化主要表现为细胞核异常(核固缩；核破裂、核溶解等改变,异染色质边缘化,异染色质增多或减少)、小肠绒毛缺失。且变化程度均随放射剂量的增加而增加。11-14Gy的形态学结果显示除了凋亡,组织主要显示出坏死的典型特征。第二章PET/CT在急性辐射病中的应用探索照射剂量因素及观察时间点因素对小肠FDG摄取的影响具有显著性。剂量因素、时间因素及两者的交互效应p值均小于0.05)固定时间因素可知：放射后6小时,2Gy组(1.15±0.16)、5Gy组(1.36±0.18)SUV值相较于对照组(1.16±0.26)无统计学差异(2、5Gy组vs对照组,p值均0.05),8Gy组(2.56±0.38)、11Gy组(2.81±0.28)、14Gy组(1.47±0.31)SUV值均高于对照组(1.16±0.26)有统计学差异,11Gy时达到最高点。放射后24小时,2Gy组(1。19±0.15)、5Gy组(2.25±0.16)、8Gy组(4.25±0.32)SUV值较对照组是依次升高的趋势(5、8Gy组vs对照组,p值均小于0.05),这个时间点SUV值的最高点出现在8Gy,11Gy组(2.20±0.12)开始低于8Gy、14Gy组(0.76±0.14)SUV值更下降到低于对照组(11Gy组、14Gy组vs对照组p值均小于0.05)。各剂量组之间比较有统计学差异(2Gy组vs5Gy组、5Gy组vs8Gy组、8Gy组vs11Gy组,所有p值均小于0.01),但11Gy组及14Gy组间并无统计学差异(11Gy组vs14Gy组,p值大于0.05)；总体来说24h时间点,SUV值的最高点出现在8Gy,低于8Gy时SUV值随剂量的增加而升高,高于8Gy随着剂量的升高而降低。放射后72小时,2Gy组(1.84±0.24)、5Gy组(2.93±0.43)SUV值较对照组(1.16±0.10)明显升高(2、5Gy组vs对照组,p值均0.05),8Gy组(7.03±0.91)、11Gy组(4.09±0.43)SUV值高于对照组且有统计学差异,反之,14Gy组(0.42±0.09)SUV值明显低于对照组(11、14Gy组vs对照组,p值均0.05),但11、14Gy组SUV值无统计学差异(11Gy vs.14Gy, p0.05).固定剂量因素可知：放射剂量为2、5、8Gy时,FDG摄取在放射后24及72小时均高于放射后6小时。其变化趋势为放射后24小时FDG摄取72小时6小时。放射剂量为11、14Gy时,FDG摄取随观察时间的延长而进行性降低。第三章急性辐射病的能量代谢损伤电镜下放射后72小时小肠超微结构进行观察,其变化主要表现为细胞核异常(核固缩；异染色质边缘化；异染色质增多或减少)、线粒体扩张及空泡化。酶活结果表明,复合酶物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ辐射后72小时的趋势大致相同。复合物酶Ⅰ各实验组与对照组均有显著性差异(P值0.05),在2-8Gy酶活性明显降低,2Gy,5Gy,8Gy组之间有显著性差异(P值0.05),8Gy,11Gy,14Gy组之间无差异；复合物酶Ⅱ2Gy与对照组无显著性差异,2G,5Gy,8Gy组之间有显著性差异(P值0.05),8Gy,11Gy,14Gy组之间无差异；复合物酶Ⅲ2Gy与对照组有显著性差异(P值0.05),其余组与对照组的显著性P值0.01,2Gy与5Gy之间的差异P值小于0.01,5Gy和8Gy组之间有显著性差异(P0.05),8Gy,11Gy,14Gy组之间无差异；复合物酶Ⅳ的变化与复合酶Ⅱ相似,低剂量辐射时,无显著性变化,从5Gy开始有明显下降,最明显的变化出现在2-5Gy之间(P0.01)。与对照组比较,实验组两条呼吸链R3、P/0及RCR均随着剂量的增加显著降低,R4随着剂量增加而增加,说明辐射导致小型猪小肠线粒体呼吸功能下降,氧化磷酸化偶联作用松弛。8Gy以下,各组组间变化明显,超过8Gy之后,呼吸功能无明显变化。不同放射剂量X线辐射后72小时小肠ATP、ADP、AMP和TAN含量(nmol/g湿重)均有显著变化且变化各具特点。(p值均小于0.01)我们发现ATP、ADP和TAN含量在2Gy到8Gy之间随着辐射剂量的增加而降低,显示出剂量效应,而8Gy之后各组腺苷酸含量之间的无统计差异。小肠线粒体能量物质与DNA的比值与单位湿重能量物质的含量趋势一致,表明能量代谢是细胞损伤的机制之一。单位湿重小肠能量物质含量与单位DNA能量物质含量与病理积分的相关性比单位湿重能量物质的变化和病理改变更加紧密。各能量物质中,TAN含量的改变和病理变化相关性最高。RT-PCR结果表明,与线粒体相关的13个基因在辐射后72小时的趋势大致相同。各实验组的表达量均与对照组显著差异,低于8Gy,各剂量组之间显著性差异,各基因的表达量明显大幅度降低,显示出剂量效应。8Gy组的表达量仅为正常组的20%左右,而高于8Gy的实验组之间无显著性差异。结论：第一章西藏小型猪急性辐射病模型的建立 1、我们在2Gy-14Gy的辐射区间内成功复制出西藏小型猪不同剂量的急性辐射病模型,小型猪辐射后外周血淋巴细胞计数、细胞凋亡率、病理变化和人类急性辐射病症状非常相似,可以作为急性辐射病的动物模型。 2、根据病理和超显微结构的观察,西藏小型猪不同剂量的急性辐射病的损伤机制存在不同,有待进一步的探索。第二章PET/CT在急性辐射病中的应用探索 1、不同时间点,PET/CT检测不同剂量组西藏小型猪急性辐射病模型,SUV值的趋势相同,均为先上升,再下降。拐点位置在8Gy。结合患者的临床症状,SUV值可作为急性辐射病诊断和预后的参考。 2、低剂量辐射后SUV值升高可能由于机体的炎症反应导致,高剂量辐射后SUV值降低主要原因为机体遭到极大损伤,组织结构破坏严重,出现坏死,生物体能量代谢障碍。第三章急性辐射病的能量代谢损伤辐射导致小肠线粒体能量生成障碍的发生是多环节、多组分共同作用的结果,辐射剂量低时,能量代谢仍能维持一定水平时,但没有完全失衡,细胞功能仍有恢复的可能；当能量物质下降到一定程度时,恢复的几率大大降低。呼吸链复合物酶活性的降低、氧化与磷酸化脱偶联加强、呼吸功能降低,mt DNA的损伤以及能量物质的改变等,均起一定的作用,这些组分均可能成为提高辐射后线粒体能量生成效率的有效干预靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R818

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