脂肪干细胞修复成纤维细胞放射性损伤的机制研究

发布时间：2018-10-19 06:34

【摘要】：核泄漏事件、日常放疗造成的医源性放射损伤和制造业的辐射消毒等使人类暴露在放射性射线的危险性大大提高。放射性皮肤损伤是放射治疗中最常见的并发症,是指放疗过程中各种放射性元素对放疗区域皮肤组织造成的肉眼可见的病损,常见的放射性元素包括X线、γ射线、质子、粒子以及电子等各类电离辐射。放射性皮肤损伤的发生率很高,若不采取保护措施,约90%的放疗患者会出现局部皮肤红斑,严重者会发生皮肤脱落和溃疡,严重影响患者生活质量。真皮和结缔组织中主要细胞组成为成纤维细胞(Fibroblasts, Fb),它在创面修复过程发挥主导作用。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是脂肪来源的具有多种分化潜能的干细胞。它取材方便、能向多种细胞分化并且能分泌多种细胞因子来修复损伤。ADSCs与放射损伤的修复关系密切,可能通过自分泌和诱导效应细胞旁分泌多种细胞因子修复放射损伤。何种细胞因子通过何种途径参与这种修复过程尚未明确。磷脂酰肌醇 3 激酶-蛋白激酶 B (phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-PKB,也称 PI3K-Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在放射损伤中的调控作用在多项研究中得到证实,近年来已明确部分长链非编码RNA (long noncoding RNA, LncRNA)在放射领域扮演重要角色,部分LncRNA与PI3K-Akt通路发生相互作用也受到关注。ADSCs在放射损伤修复中通过何种信号通路发挥作用,LncRNA是否参与其修复机制目前尚未明确。基于以上考虑,本课题拟通过高通量测序和基因沉默技术对ADSCs修复放射性损伤机制进行研究。第一部分ADSCs和Fb原代培养、共培养模型的建立以及ADSCs对Fb放射损伤后的影响目的:原代提取ADSCs和Fb,建立共培养模型研究ADSCs的干预对放射损伤成纤维细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法:用酶消化法从大鼠腹股沟脂肪和真皮组织中原代提取ADSCs和Fb,通过流式细胞技术、多向诱导分化以及免疫细胞化学进行鉴定。用0.4μmTranswell共培养板建立非接触式共培养模型,建模成功后实验分为4组,Fb1组为成纤维细胞对照组,F2组为8Gy X射线照射的成纤维细胞组,Fb3组为ADSCs干预的8GyX射线照射的成纤维细胞组,NRK组为NRK细胞干预的8GyX射线照射的成纤维细胞组(阴性对照)。CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡和周期变化。结果:酶消化法能提取较高纯度原代细胞,经鉴定提取的ADSCs可向成骨、成脂肪诱导分化,ADSCs表面标志物CD29、CD44、CD31和CD45阳性率达标,成纤维细胞高表达波形蛋白Vimentin。Fb2组经8Gy放射损伤的成纤维细胞较Fb1对照组增殖能力显著下降,差异有统计学意义(P 0.05),Fb3组ADSCs共培养干预后的成纤维细胞增殖能力较Fb2组显著增加,差异有统计学意义(P 0.05)。Fb2组较Fb1对照组凋亡显著上升,差异有统计学意义(P 0.05) , Fb3组ADSCs共培养干预后的成纤维细胞凋亡较Fb2组显著下降,差异有统计学意义(P 0.05)。8Gy照射后Fb2组成纤维细胞周期阻滞在G2期,ADSCs干预后Fb3组细胞周期较Fb2组由G2/M向G1/S进展,差异有统计学意义(P0.05)。结论:成纤维细胞在接受了 8Gy X射线放照射后细胞增殖活力减弱、凋亡增加、周期阻滞在G2期。当我们进行了 ADSCs的共培养干预后成纤维细胞增殖活力增强、凋亡减少、细胞周期进程加快。第二部分ADSCs对大鼠放射性皮肤损伤的影响目的:研究ADSCs在大鼠放射性皮肤损伤模型体内的存活情况以及对大鼠放射性皮肤损伤导致的凋亡的影响。方法:改良RifkinLH皮肤放射模型,实验分为5组,空白对照组、单纯照射组、ADSCs静脉注射组、ADSCs局部注射组和PBS局部注射组。照射采用背部2cm×2cm区域接受20Gy照射,ADSCs注射量为2×106,Luciferase和GFP双标慢病毒转染标记。不同时间点用小动物活体成像系统观察ADSCs在体内存活情况,取材进行冰冻切片在荧光显微镜下观察,制作石蜡切片行Tunnel凋亡染色。结果:ADSCs静脉注射组出现肺拦截,24h左右活体成像显示荧光消失,ADSCs局部注射组至少在注射后15天内仍然能够检测到荧光。单纯照射组较空白对照组凋亡显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。ADSCs局部注射组较单纯照射组凋亡显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。ADSCs静脉注射组较单纯照射组凋亡降低(P0.05),差异有统计学意义。结论:2×106 ADSCs局部注射在经20Gy照射的大鼠背部皮肤可以至少存活15天,ADSCs可以减轻放射性皮肤损伤导致的凋亡。第三部分ADSCs对Fb放射性损伤干预的高通量mRNA/LncRNA测序、蛋白质谱检测以及验证目的:ADSCs共培养干预放射损伤的成纤维细胞,筛查基因和蛋白水平的差异表达,预测可能发挥作用的信号通路并进行验证。方法:实验分为空白对照Fb组、8Gy照射后的Fb2组以及经ADSCs共培养干预后的Fb3组。采用高通量mRNA/LncRNA测序和蛋白质谱检测筛选出差异基因和蛋白,测序和蛋白质谱联合分析可能作用的信号通路,筛查LncRNA并预测靶基因。结果:8Gy照射后的Fb2组较空白对照组P53通路发生明显上调。经ADSCs共培养干预后的Fb3组较单纯8Gy照射的Fb2组PI3K-Akt和MAPK通路显著上调。Real time-PCR和Western-blot验证与以上通路相关的凋亡和周期分子,Fb2 vs Fb1上调的有 P53、P21、P27、CyclinB、Bax 以及 CleavedCaspase-3,差异有统计学意义(P0.05);下调的有CyclinD1、Bcl-2,差异有统计学意义(P0.05)。Fb3vs Fb2上调的有CyclinD1、Bcl-2和c-myc,差异有统计学意义(P0.05);下调的有 CyclinB、Bax、CleavedCaspase-3、P21 和 P27,差异有统计学意义(P0.05)。从筛查出的40条LncRNA结合Real time-PCR验证,锁定变化最显着的4条,分别是 LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034 和 LNC_001030。结论:8Gy X线照射后的成纤维细胞可能通过P53通路上调介导放射损伤,ADSCs可能通过PI3K-Akt和MAPK通路激活使成纤维细胞发生修复。LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034 和 LNC_001030 可能在 ADSCs修复成纤维细胞放射损伤中扮演重要角色。第四部分ADSCs修复成纤维细胞放射性损伤的机制研究目的:检测共培养上清液中差异表达的细胞因子,用筛查出的细胞因子干预放射损伤成纤维细胞后研究其增殖、凋亡和细胞周期的变化以及在信号通路中的作用。初步探讨LncRNA_473在ADSCs修复成纤维细胞放射损伤中的作用。方法:细胞因子蛋白芯片筛查共培养上清中的差异表达并进行Elisa验证。用筛查出的细胞因子刺激放射损伤的成纤维细胞,检测其增殖、凋亡及周期的变化,Western-blot检测相关通路的激活情况。成纤维细胞转染shRNA沉默LncRNA_473,检测ADSCs共培养干预下成纤维细胞增殖和凋亡情况。结果:细胞因子GM-CSF组和VEGF组较对照组p-Akt和p-Erk表达上调,差异有统计学意义(P0.05),这说明GM-CSF组和VEGF可能通过激活P13K-Akt和MAPK通路发挥放射损伤修复作用。ADSCs共培养同时沉默LncRNA_473,成纤维细胞增殖能力较单纯ADSCs共培养组成纤维细胞增殖能力下降、凋亡增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论:GM-CSF、VEGF和LncRNA 473可能在ADSCs修复成纤维细胞放射损伤中发挥重要作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R818

【参考文献】

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2 苏仲奕;杨在亮;汤永永;扈江伟;盛宏霞;徐曼;张斌;陈虎;;人脐带间充质干细胞修复大鼠放射复合皮肤损伤及其体外致瘤性[J];中国组织工程研究;2014年37期

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本文编号：2280424