模拟微重力影响大鼠甲状腺滤泡上皮细胞miRNA表达的研究

发布时间：2020-04-28 14:41

【摘要】：背景和目的随着中国载人航天事业的不断发展,空间站的建设提上了日程,进入外太空的航天员会越来越多,并且在轨飞行时间会越来越长,太空环境对航天员的健康影响越来越成为医监医保工作的重点。失重,作为太空环境中的一个重要而且无法避免的因素,对生物体的影响广泛而且复杂,甲状腺也不例外。mi RNA(micro RNA)是一类21-25nt长的高度保守的小分子非编码RNA,它几乎参与了机体所有的生理和病理过程。本实验采用旋转细胞培养系统(Rotating Cell Culture System,RCCS)模拟微重力环境的方法,研究大鼠甲状腺滤泡上皮细胞FRTL-5在模拟微重力条件下mi RNA的表达谱变化,并分析其靶基因的相关功能与细胞通路,为失重环境下生物体内分泌系统的变化提供理论依据。研究方法(1)购置大鼠甲状腺滤泡上皮细胞FRTL-5细胞株,采用RCCS建立微重力培养体系,选取生长状态良好的4-10代对数生长期细胞随机分为两组:正常重力组(normal gravity group,NG)和模拟微重力组(simulated microgravity group,SMG),每组3个样本,每个样本均培养24小时。提取样本总RNA,进行荧光标记和芯片杂交。采用Feature Extraction软件处理杂交图像提取原始数据,应用Genespring软件进行分位数标准化和后续处理,筛选差异表达显著的mi RNA,将表达变化倍数与对照组相比较在2倍以上,并且在统计学上具有显著差异(p0.05)的mi RNA确定为差异mi RNA。选取差异显著同时原始信号值较强的数个mi RNA进行q RT-PCR验证,从而验证芯片结果的可靠性。(2)针对本研究第一阶段筛选出的mi RNA,通过mi RNA靶基因预测数据库进行靶基因预测,对预测靶基因分别进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,判定差异mi RNA主控的生物学过程和信号通路,对关键mi RNA的功能进行初步预测。结果(1)研究发现,大鼠甲状腺滤泡上皮细胞FRTL-5在RCCS模拟微重力环境条件下,mi RNA表达谱发生明显变化,筛查共有81个差异表达的mi RNA,相较于NG组细胞SMG组53个明显上调,28个明显下调。对差异表达显著且原始信号值较高的3条mi RNA进行实时荧光定量PCR验证,定量PCR结果与芯片检测结果基本一致。(2)对模拟微重力环境下大鼠甲状腺滤泡上皮细胞差异表达的mi RNA进行靶基因预测,进一步GO分析显示这些差异mi RNAs主要参与了老化、凋亡、对低氧的反应、转录、细胞粘附及炎症反应等生物学过程。通过pathway分析显示,差异表达的mi RNA主要参与有低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、c GMP-PKG信号通路、Fox O信号通路及多种甲状腺激素调节通路相关通路,如NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路等。结论Agilent mi RNA芯片技术可高效、准确的对差异mi RNA进行筛选;微重力环境下大鼠甲状腺滤泡上皮细胞mi RNA表达谱发生显著变化;基于芯片技术的mi RNA靶基因预测和功能富集分析可为失重应激损伤机制和修复措施的研究提供一定的基础理论依据。
【图文】：

电泳图,电泳图,实验要求,总量

符合实验要求。表 5 样品检测结果Tab 5 Sample test results号浓度（μg/μl）A260/280 A260/230体积(μl)总量（μg）210028S/18S 1 0.1851 2.06 0.98 10 1.85 0.7 2 0.1210 2.04 1.80 10 1.21 0.7 3 0.1634 2.05 0.59 10 1.63 0.7 1 0.0939 2.03 1.80 10 0.94 2.2 2 0.0768 2.05 1.19 20 1.54 2.3 3 0.1020 1.97 0.78 10 1.02 2.4

扫描图,扫描图,芯片,清晰度

芯片检测结果miRNA表达在微重力组中与正常重力组中的变化倍数在2倍以上并P＜0.05）的基因，确定为差异性表达的 miRNA，，共 81 条，其中 2 调的 miRNA 共 53 条，2 倍以上表达降低的共 28 条。芯片杂交扫描图片杂交后经扫描得到的荧光强度图，可反映芯片杂交状况，图中的、清晰度，致密度及均匀度与杂交情况呈正比。本次实验结果显示清晰度、均匀度均较好（如图 2 所示），杂交状况满意。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R852.22

【参考文献】