乳腺癌及妇科肿瘤组织常染色体SNP突变分析

发布时间：2017-03-24 04:06

  本文关键词：乳腺癌及妇科肿瘤组织常染色体SNP突变分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:在法医日常司法鉴定实践活动中,除了常见的血液、血痕、毛发、唾液等检材外,还有一类特殊的检材,即肿瘤组织,在某些特定情况下可能成为检案唯一的参照样本。与STR相比,SNP具有突变率低和易于检测等特点,从而对于肿瘤组织身源认定具有潜在的应用价值。但是目前国内外尚缺乏对肿瘤组织SNP稳定性的系统研究。本研究旨在探讨妇科肿瘤组织和乳腺癌组织的SNP突变规律,并分析肿瘤类型、组织类型、分化程度、临床分期对SNP突变率的影响,以系统评估SNP对该两种肿瘤组织的法医学检验的实际应用价值,并探索应对肿瘤来源生物学检材的高效、准确的SNP分型方法,以期对此类案件的法医学检验提供参考。方法:1样本采集:本实验中所使用样本为本科室前期采集的63例乳腺癌和62例妇科恶性肿瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,以及10例妇科良性肿瘤组织及正常对照组织。相应地包括患者的年龄、肿瘤类型、组织类型、临床分期、分化程度等信息。2 DNA提取:分别用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取妇科肿瘤和乳腺癌的肿瘤组织、癌旁正常组织DNA,采用ND-1000蛋白核酸定量仪定量。3 SNP分型:采用SNap Shot multiplex kit试剂盒扩增肿瘤组织及正常组织DNA的55个常染色体SNP基因座;然后进行PCR反应产物纯化、单碱基延伸反应、单碱基延伸反应产物纯化、ABI 3130基因分析仪对单碱基延伸反应纯化产物进行电泳分型,使用Gene Mapper?v3.2软件分析结果,得到肿瘤组织、正常组织的SNP分型。比对来自同一个体的正常组织和肿瘤组织的SNP分型结果,记录突变的位点和类型。4等位基因特异性PCR扩增(AS-PCR)4.1 AS-PCR引物设计:从55个SNP位点中选择18个基因座,其中9个为检测到突变的基因座,9个为未检测到突变的基因座。根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/网站公布的参考序列,结合引物设计软件Primer Premier 6.0和oligo 7.0,以及NCBI blast比对结果,对选取的18个SNP基因座重新设计AS-PCR的两条等位基因特异性引物和一条通用引物。为增加引物的特异性,在两条等位基因特异性引物中均额外引入一个错配碱基;此外,在其中一条等位基因特异性引物5'端加入一段与模板DNA不配对的核苷酸序列,将SNP序列差异转换为长度差异,便于后续毛细管电泳检测。4.2单位点等位基因特异性PCR扩增:为验证单位点AS-PCR分型体系的准确性,选取4例已知SNP分型的健康个体DNA样本,分别采用Q5超保真DNA聚合酶和Ampli Taq Gold DNA聚合酶对其DNA进行AS-PCR,产物经ABI 3130基因分析仪进行检测,Data Collection V3.0软件采集数据,Genemapper V3.2软件分析数据得到SNP分型。5 SNP突变验证:采取多次重复SNap Shot实验、单等位基因Sanger测序、单位点AS-PCR对部分突变位点进行验证。6统计学分析:应用Excel、SPSS v21.0软件对上述实验结果进行统计学分析,用χ~2检验分别比较妇科肿瘤和乳腺癌不同肿瘤类型、组织类型、分化程度的SNP突变差异;用秩和检验分别比较两种肿瘤不同临床分期的SNP突变差异;用χ~2检验比较妇科肿瘤与乳腺癌组织之间SNP突变率的差异。结果:1 AS-PCR体系构建及准确性验证设计了18个SNPs位点的AS-PCR引物,引物长度18~32个碱基,扩增产物长度107~217bp。见Table1。4例已知SNP分型的DNA样本经AS-PCR,结果显示Q5超保真DNA聚合酶得到的SNP分型存在非特异性扩增,与已知分型均不一致;而Ampli Taq Gold DNA聚合酶得到的SNP分型结果与已知分型完全一致,结果正确。选取六个SNP位点的等位基因进行Sanger测序,其中rs1109037、rs740598、rs10092491测序失败,其余三个位点rs2342747、rs6444724、rs159606的等位基因序列与NCBI网站提供的标准序列一致,验证了所构建的AS-PCR分型体系的准确性。2妇科肿瘤组织的SNP突变10例妇科良性肿瘤组织未检出突变;62例妇科恶性肿瘤组织经SNap Shot方法分型后,共发现5例样本的五个SNP位点发生了突变,突变类型表现为杂合性丢失,包括9号样本和29号样本的rs13218440、16号样本的rs1523537、18号样本的rs1498553和28号样本的rs315791。选取9号、18号、29号样本进行AS-PCR,并对9号、18号、28号、29号肿瘤组织DNA进行Sanger测序。16号样本的rs1523537位点三次SNap Shot分型结果一致,故未采用其它方法进行验证。综合上述三种方法的实验结果,确定有3例(9号、16号、28号)妇科肿瘤组织共3个SNP(rs13218440、rs1523537、rs315791)存在突变,突变类型均为等位基因杂合性丢失。比较良、恶性妇科肿瘤组织SNP突变率,其差异无统计学意义(P0.05)。经过χ~2检验分别比较妇科三种不同肿瘤类型、组织类型、分化程度的SNP突变率,均未发现统计学差异。经秩和检验结果显示,妇科肿瘤组织不同临床分期的SNP突变率亦无统计学差异。比较妇科肿瘤组织SNP与本实验室前期STR检测结果,在样本及基因座水平SNP突变率均显著低于STR突变率(P0.05)。3乳腺癌的SNP突变63例乳腺癌样本经SNap Shot方法分型后,共三对样本26个SNP位点发生了突变,包括2号的rs445251、40号的rs2270529和7号的24个SNP位点。选取了7号样本的15个SNP位点进行Sanger测序,以及7个SNP位点进行AS-PCR验证。综合分析实验结果,确定上述3例乳腺癌样本共21个SNP位点存在突变,其中15个SNP位点突变类型为等位基因杂合性丢失,2个为纯合子突变为杂合子(rs1478829:T→T/A,rs1821380:C→G/C),3个为SNP位点转换(rs8078417:A→G,rs338882:C→T,rs1027895:C→T),1个为SNP位点颠换(rs10776839:A→C)。经秩和检验结果显示,乳腺肿瘤组织不同临床分期的SNP突变率无统计学差异。经χ~2检验结果显示,中高分化和低分化乳腺癌组织的个体SNP突变无统计学差异。比较乳腺癌SNP与本实验室前期STR检测结果,在样本及基因座水平SNP突变率均显著低于STR突变率(P0.05)。4妇科与乳腺肿瘤的SNP突变比较:经χ~2检验,妇科肿瘤组织与乳腺癌在个体水平SNP突变率无统计学差异,而乳腺癌的SNP突变位点数显著多于妇科肿瘤组织(P0.05)。结论:1在乳腺癌和妇科肿瘤组织SNP突变率低于STR,有望筛选到稳定的SNP体系应用于肿瘤组织身源鉴定。2 AS-PCR对肿瘤组织SNP分型准确、方法简便,为法医物证检验提供一种有效的检测方法。
【关键词】：单核苷酸多态性 妇科肿瘤 乳腺癌 突变 等位基因特异性聚合酶链反应
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-31
• 结果31-35
• 附图35-53
• 附表53-64
• 讨论64-70
• 结论70-71
• 参考文献71-74
• 综述 肿瘤组织SNP的检测及相关方法74-85
• 参考文献81-85
• 致谢85-86
• 个人简历86

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本文编号：265042