IER5在放射损伤HeLa细胞中对Cdc25B基因的转录调控机制研究

发布时间：2020-05-16 09:27

【摘要】：目的:IER5(Immediate early response 5)作于慢动力早期反应基因家族中的一员,其广泛存在于人体各组织脏器中,且在消化系统、生殖系统及泌尿系统肿瘤组织中较癌旁组织呈现较高表达,IER5的表达可能与恶性肿瘤的不良预后有关。在前期研究中,IER5的表达抑制促进HeLa细胞的增殖并减轻辐射诱导的增殖抑制,从而增加其辐射抗性。相反,IER5过表达扰乱了细胞周期检查点并使细胞产生辐射敏感性。然而,IER5在调节细胞周期中的信号途径和机制仍不清楚。本论文主要围绕受辐射影响上调的IER5如何进行周期表达调控这一主线,找出受IER5影响的一个关键细胞周期调控蛋白——Cdc25B,以Cdc25B为突破口探索IER5在放射损伤细胞周期调控反应中的作用及具体机制。方法:(1)对IER5正常的HeLa细胞和沉默IER5的HeLa细胞分别进行4Gy γ射线照射,于照射后不同的时间点收取细胞总RNA和总蛋白,进行qPCR和Western Blotting实验,检测IER5及Cdc25B mRNA及蛋白水平变化,分析辐照后二者间的表达关系。(2)构建Cdc25B基因启动子双荧光素酶重组质粒,查看辐照对Cdc25B转录活性的影响,找到受辐射影响的反应元件存在的启动子区域。对这一区域进行生物信息分析,采用重叠延伸技术进行特定位点突变。进一步明确这些特定位点在辐射介导的Cdc25B调控中所起的作用。(3)在293T细胞中,利用Cdc25B基因启动子双荧光素酶重组质粒和IER5表达质粒,检测IER5是否与Cdc25B启动子存在相互作用及相互作用区域。(4)在HeLa细胞中,瞬时转染点突变质粒的同时利用siRNA敲降IER5,查看IER5是否可以通过特异位点参与辐射介导的Cdc25B表达调控。(5)通过ChIP-PCR查看辐射后Cdc25B启动子区IER5、Sp1、Sp3、NF-YB关键转录因子的富集效率变化。在HeLa细胞中,利用siRNA敲降IER5,查看IER5敲降是否影响辐射介导的Cdc25B这几个关键转录因子变化。(6)通过qPCR和Western Blotting实验查看IER5和NF-YB共敲降是否能够阻断NF-YB敲降引起的Cdc25B下调。结果:(1)HeLa细胞与沉默IER5的HeLa细胞经60Coγ射线照射后,IER5与Cdc25B间存在表达变化相反趋势。但沉默IER5的HeLa细胞Cdc25B在8h下调比例明显减少(0.225倍vs 0.662倍,P0.01)。因此,认为辐射引起的IER5表达上调对辐射引起的Cdc25B表达下调存在调控作用。(2)利用构建成功的Cdc25B基因启动子双荧光素酶重组质粒,辐射后Cdc25B启动子活性明显降低(P0.001),且受辐射影响的反应元件存在于Cdc25B启动子的-160～-53区域内。突变该区域内特异位点,发现辐射后Sp1/Sp3突变和NF-YB突变的启动子活性降低(P0.05),但并未引起SP1/SP3和NF-YB联合突变启动子活性明显变化。这表明,Sp1/Sp3和NF-YB结合位点均参与了辐射介导的Cdc25B表达调控。(3)IER5表达能够明显降低Cdc25B转录活性(P0.001),且受IER5表达影响的反应元件也存在于-160～-53区域内。IER5过表达通过NF-YB结合位点降低Cdc25B基因启动子的活性。(4)IER5通过NF-YB结合位点参与辐射介导的Cdc25B表达调控。(5)通过ChIP-PCR凝胶电泳显示:IER5蛋白结合在Cdc25B启动子上。与不接受照射相比Sp1、Sp3、NF-YB在照射后富集效率均出现明显下降(P0.01),反而IER5在照射后富集效率上升(P0.01)。p300作为已知的与NF-YB相互作用的共激活因子,辐照后p300也显著释放(P0.01)。IER5敲降后阻断了辐射引起的NF-YB结合释放。(6)通过qPCR和Western Blotting实验查看IER5和NF-YB共敲降能够明显阻断NF-YB敲降引起的Cdc25B下调。结论:在HeLa细胞中辐照引起IER5表达上调,通过从Cdc25B启动子区释放NF-YB而结合更多的IER5对其进行转录抑制调控。
【图文】：

为表征辐照后ＩＥＲ５与Ｃｄｃ２５Ｂ间的关系，首先对处于对数生长期的ＨｅＬａ细胞逡逑采取４Ｇｙ邋Ｙ射线照射，辐照后分别在０．５邋ｈ、４邋ｈ、８邋ｈ、１２邋ｈ、２４邋ｈ查看ＩＥＲ５与Ｃｄｃ２５Ｂ逡逑间的ｍＲＮＡ及蛋白水平变化。如图３．１邋Ａ－Ｂ所示，发现ＩＥＲ５在４邋ｈ起即表达上调，逡逑８ｈ上调比例最大，１２ｈ上调比例略有下降。但Ｃｄｃ２５Ｂ在４ｈ以后出现明显的表达逡逑下调，１２ｈ下调比例最明显，在８ｈ下调比例为０．２２５±０．邋０７２倍。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ逡逑ＩＲ邋（４Ｇｙ）逡逑Ｔｉｍｅ／ｈ邋￣￣＾逦ｇ逦￣２￣￣逦５＂１逦ＩＥＲ５邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｒ１．５逡逑ＩＥＲ５｜—逦ｐ，４－逦＾，ｇ逡逑逦邋￡邋１３－逡逑Ｃｄｃ２５Ｂ邋—ｐ逦一邋．邋ｇ邋＜逦＼Ｖ逦．逦＞邋ｃｄ逡逑逦邋逦逦邋Ｊｖ．．

Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３．邋Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｇｅｎｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑接着，，我们利用ＰＣＲ反应克隆获取Ｃｄｃ２５Ｂ基因启动子片段，经琼脂糖凝胶电逡逑泳检测发现在２，０００邋ｂｐ附近可见单一条带，见图３．４邋Ａ，这恰好与调取Ｃｄｃ２５Ｂ基因逡逑启动子片段大小完全相符。将其克隆至双荧光素酶通用载体ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切验逡逑证可在２，０００邋ｂｐ和５，０００邋ｂｐ附近出现两条清晰条带，这与插入的目的片段和线性通逡逑用载体大小完全一致，见图３．４邋Ｂ。经测序比对后，与目的片段的理论序列完全一致，逡逑质粒构建正确，将其命名为ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０。逡逑为进一步明确Ｃｄｃ２５Ｂ基因特异调控的具体区域，以构建成功的逡逑ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０质粒为模板，利用ＰＣＲ反应扩增出６条启动子缺失片段，如图逡逑３．４Ｃ所示。分别将其克隆至双荧光素酶通用载体ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切验证，如图逡逑３．４邋Ｄ所示。系列缺失重组质粒均可双酶切得到大小正确的条带，经测序比对与理论逡逑序列完全一致
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R818

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