19个X-STR荧光检测体系的法医学验证及其多态性调查

发布时间：2020-05-21 17:50

【摘要】：研究背景自19世纪80年代末90年代初开始,STR分型技术逐渐被广泛应用于法医工作的个体识别和亲权鉴定实践中。作为第二代DNA遗传标记的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)也以其在基因组中分布广泛、遗传多态性信息含量高、检测高效快速、数据分析简便以及标准化、自动化程度高等特点,被广泛应用在法医工作实践、目的基因检测及基因诊断、器官移植、动植物育种、基因定位、群体遗传研究、种群进化等实际应用和基础研究领域。与常染色体STR和Y染色体STR复合扩增体系在法医实践中的广泛应用相比,X染色体STR相关复合扩增体系的建立和商品试剂盒的开发一直处于缓慢发展阶段。而X染色体STR在复杂亲权关系和混合疑难检材鉴定实践中有着重要甚至不可替代的作用。目前国际上应用最广泛的是德国QIANGEN公司的ARGUS X12试剂盒。而本文选取的19个X-STR荧光检测体系(即AGCU X19荧光检测体系)较之有着更多的连锁群,更高的分辨率,本研究对该体系进行法医学验证,并收集国内河南汉族、浙江汉族、宁夏回族、新疆维吾尔族、西藏藏族、广西壮族、广西瑶族、广西仫佬族八个民族人群样本进行多态性调查,为法医实践和群体遗传研究提供基础数据。目的对 19 个 X-STR 基因座(DXS7423,DXS10148,DXS8378,DXS10162,DXS7132,DXS10079,DXS10103,DXS10101,HPTRB,DXS10074,DXS10135,DXS10159,DXS10164,DXS10075,DXS6809,DXS6789,DXS7424,DXS101,DXS10134)的复合扩增体系进行法医学应用验证,并针对国内河南汉族、浙江汉族、宁夏回族、新疆维吾尔族、西藏藏族、广西壮族、广西瑶族、广西仫佬族八个民族人群做群体多态性调查,为法医应用提供基础数据。应用X-STR基因座的等位基因分布,对不同地区的人群进行遗传距离计算,分析群体遗传距离,为群体遗传学、人类学、民族学、考古学、非物质文化遗产保护等领域提供重要的参考价值。方法依据 DNA 分析方法科学工作组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM)验证指南,对19个X-STR荧光检测体系进行法医学验证。采集我国河南汉族、浙江汉族、新疆维吾尔族、西藏藏族、宁夏回族、广西壮族、广西瑶族、广西仫佬族八个民族共计2157份无关个体样本,使用19个X-STR荧光检测体系进行X染色体STR分型检测,计算各基因座等位基因分布、进行基因座独立性检验,统计遗传多态性、个体识别力、非父排除率等法医学参数,统计分析各人群之间遗传距离、亲缘关系和人群迁徙进化。结果体系验证可知,19个X-STR荧光检测体系的灵敏度为0.125ng,对0.0625ng模板量的样本能检出大部分的等位基因。对非人源DNA有无特异性扩增。对法医实践工作常见的抑制剂(300μmol/L血红素浓度、10 mmol/L靛蓝浓度、50μg/μ1腐殖酸浓度、2.5mmol/L的离子、400 μ mol/L血红蛋白浓度、1200 mMEDTA浓度)有较好的耐受性。等位基因片段迁移偏差小于0.2bp,低于遗传分析的0.5bp的分辨容忍度,分型准确。该检测体系在不同实验室不同仪器上对相同样本分型结果抑制,可重复性好。stutter比率低于150%,不影响正常分型,结果可靠。对大部分的常见日常案件检材均可得到完整分型。该体系对混合比例为1:1～1:9的混合样本分型可有效区分优劣势供体。体系PCR反应组分在0.75×～1.25×之间时,仍能得到完整分型,当一种组分降到0.5×时,会出现等位基因丢失,可知该体系对组分浓度变化的容忍尺度大,满足实际需要。PCR循环数梯度实验表明,循环数在28～30次之间,可得到完整分型,且荧光值随循环数的增加而增加,扩增均衡性较好。当循环数大于等于31次时,会出现个别等位基因的荧光渗透,但扩增均衡性仍较好。因此,实际应用时,可依据样本模板量在一定范围内调节PCR的循环次数。该体系在退火温度58℃～62℃之间均可得到可靠结果。60℃时产物片断荧光峰值和特异性最好。当该体系终延伸时间设置为30min时,可以最大程度的减小各等位基因A肩峰。综上所述,依据SWGDAM验证指南,19个X-STR荧光检测体系符合法医实践的要求。在群体多态性调查方面,19个X-STR基因座在国内河南汉族、新疆维吾尔族、西藏藏族、宁夏回族、广西壮族、广西瑶族、广西仫佬族八个民族共计2157份无关个体种检测出353个等位基因,等位基因频率范围在0.0013～0.7094之间,最高的是广西瑶族DXS10164的10等位基因;19个X-STR位点的遗传多态性信息含量在0.4106～0.9277之间。不同人群中处于连锁不平衡状态的配对基因座不同,可位于同一连锁簇、亦可位于不同连锁簇,且并非同一连锁簇内的配对基因座均处于连锁不平衡状态。因此,配对基因座连锁不平衡状态既与物理距离和遗传距离相关,又与群体遗传结构相关。19个X染色体STR基因座作为七个连锁簇联合应用时,该体系在把八个民族人群中的女性累积个体识别力均达到1.000 000 000 000 000,男性累积个体识别力在0.999 999 999 402265~0.999 999 999 996 670 之间,累计三联体排除率在 0.999 999 999 188144~0.999 999 999 995 949 之间,累计二联体排除率在 0.999 999 942 863498~0.999 999 999 638 495之间,均有着较高的个体识别力和非父排除力可为法医实践提供有价值的信息。在本研究八个民族人群的遗传关系分析中,藏族、维吾尔族分为一支,与其他六个民与其他民族遗传关系较远。河南汉族、浙江汉族、宁夏回族、广西壮族、广西仫佬族遗传关系较近。广西三个民族与宁夏回族分于一支,但是广西瑶族与另外三个民族遗传关系较远,可能与采样地点偏远有关。同时,在与日本人、非洲黑人、欧洲高加索人的遗传关系分析中,可得出人种间的遗传关系差异。结论本研究选取的19个X-STR荧光检测体系有较好的灵敏度、种属特异性、混合样本检验能力,重复性、一致性好,分型准确。该体系在八个民族人群的累积个体识别力和非父排除率满足实际应用需要,可以为复杂亲权鉴定和混合样本检验提供有效技术手段。对八个民族人群进行多态新性调查,为法医学应用和群体遗传研究提供基础数据。
【图文】：

图１－１法医学常用的Ｘ－ＳＴＲ基因座逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎｌｙ邋ｕｓｅｄ邋Ｘ－ＳＴＲｓ邋ｉｎ邋ｆｏｒｅｎｓｉｃ邋ｓｃｉｅｎｃ?

ＤＮＡ９９４７ａ、９９４８进行扩增电泳。５２份样本在两个扩增体系的６个重合基因座逡逑（ＤＸＳ７４２４、ＤＸＳ８３７８、ＤＸＳ６７８９、ＤＸＳ１０１５９、ＤＸＳ１０１、ＤＸＳ７４２３）得出相逡逑同的基因分型，，例ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＤＮＡ９９４７ａ和９９４８见图２－６，表明１９个Ｘ－ＳＴＲ荧光逡逑检测系统分型数据可靠
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：D919

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本文编号：2674670