肺内皮细胞靶向肽修饰的成纤维细胞生长因子对放射性肺损伤的修复

发布时间：2020-05-24 23:40

【摘要】：背景和目的:放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI)是核事故幸存者的主要并发症,长期困扰着生存病人的生活质量。RILI也是胸部肿瘤放疗剂量的主要限制因素,影响肿瘤的控制效果。RILI的发生机制非常复杂,涉及到一系列细胞及分子的相互作用,病理上主要表现为炎症细胞的迁移与浸润、成纤维细胞的增生与分化、胶原蛋白的分泌与积聚、血管壁的增厚与闭塞、正常肺泡结构的破坏与重塑等。近年研究发现,在放射损伤后数个小时内发生的血管内皮细胞凋亡可能是导致上述病理表现的启动机制,阻断血管内皮细胞的凋亡可以缓解放射损伤的程度。成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)广泛参与胚胎发育、组织再生、血管生成等多种生物学过程,也在皮肤、骨、尿道、子宫、神经等组织器官的缺损或损伤模型中发挥促修复作用。研究发现,bFGF也在放射损伤中发挥保护作用,主要机制为抑制血管内皮细胞的凋亡。此外,微血管内皮细胞对辐照的敏感性明显高于大血管,可能与bFGF在微血管基底膜上的分布较少甚至缺乏有关。肺具有异常丰富的微血管系统,缺乏足够的bFGF提供保护可能是肺对射线较为敏感的原因之一,因此外源性给予bFGF可能是缓解与修复RILI的有效方法。但是,bFGF在应用中常面临着靶向性低、透膜能力差、半衰期短等问题,为了达到有效的治疗效应,需要提高bFGF的使用剂量,但是高剂量给药可能会对其他正常组织造成潜在危险。靶向给药是近年来的研究热点,可以提高病灶中的药物浓度,降低正常组织中的药物分布,从而在增强治疗效应的同时降低副作用。其中,靶向性多肽是一种具有良好应用前景的递送配体,具有渗透性好、合成方便、免疫原性低、成本低、易修饰等优点。CGSPGWVRC是通过噬菌体展示技术获得的肺血管内皮细胞靶向肽(Lung endothelial cell-targeted peptide,LET),并经体外和体内实验证实了其较好的肺内皮细胞靶向能力。综上所述,我们准备用LET对bFGF进行修饰(LET-bFGF),以提高bFGF重组蛋白对肺内皮细胞的靶向能力,从而增强bFGF对RILI的修复功能。方法:1.LET-bFGF的制备:在pET28a-bFGF质粒的基础上,将一段Linker序列(共15个氨基酸,即45个核苷酸)和LET序列(共9个氨基酸,即27个核苷酸)连接至bFGF的羧基端,通过PCR、酶切、连接、转化、筛选等方法构建pET28a-LET-bFGF质粒,然后通过大肠杆菌表达系统获得LET-bFGF重组蛋白,使用镍柱亲和层析法进行纯化,最后采用MTT试验检测生物学活性。2.LET-bFGF的肺靶向验证:27只SD大鼠随机分为3组:对照组、bFGF组、LET-bFGF组。bFGF组和LET-bFGF组分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF(25 nmol/kg),对照组使用生理盐水作为对照。在注射后10 min、1 h和6 h时,Elisa检测肺组织和血清中bFGF的含量。24只SD大鼠随机分为4组:正常+bFGF组、放射+bFGF组、正常+LET-bFGF组、放射+LET-bFGF组。正常组使用正常大鼠,放射组使用RILI大鼠,bFGF组和LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射偶联了Cy7的bFGF(bFGF-Cy7)和偶联了Cy7的LET-bFGF(LET-bFGF-Cy7)(500μL,30μmol/L)。在注射后1 h时,小动物活体成像检测在体和离体器官的荧光强度。24只SD大鼠随机分为4组:正常+bFGF组、放射+bFGF组、正常+LET-bFGF组、放射+LET-bFGF组。正常组使用正常大鼠,放射组使用RILI大鼠,bFGF组和LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF(100 nmol/kg)。在注射后1h时,免疫荧光染色检测外源性bFGF在肺组织中的分布。3.LET-bFGF对RILI大鼠模型的修复作用:60只SD大鼠随机分为4组:对照组、放射组、放射+bFGF组、放射+LET-bFGF组。对照组使用正常大鼠,其余三组使用RILI大鼠,放射+bFGF组和放射+LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF(25 nmol/kg),对照组和放射组使用生理盐水作为对照。在造模后早期(4 h),取肺组织进行TUNEL与CD31的双重染色,以检测LET-bFGF对肺血管内皮细胞凋亡的保护作用;在造模后远期(2个月),对大鼠进行肺部CT扫描,取肺组织进行HE染色、Masson染色和CD45的免疫组织化学染色,以检测LET-bFGF对肺炎和肺纤维化的治疗效应。结果:1.在pET28a-bFGF质粒的基础上,成功将一段45个核苷酸的Linker和27个核苷酸的LET序列连接于bFGF序列的羧基端,最终获得pET28a-LET-bFGF质粒,测序验证序列完全正确。2.通过大肠杆菌表达系统和镍柱亲和层析法获得纯化蛋白,经SDS-PAGE证实bFGF和LET-bFGF均符合理论分子量,分别为19.42 kD和21.50 kD,WB证实bFGF和LET-bFGF均可以与抗bFGF抗体特异性结合。3.bFGF与LET-bFGF均具有较好的生物学活性,而且LET靶向肽与Linker在bFGF羧基端的融合表达并未影响bFGF的生物学活性。4.LET-bFGF经尾静脉注射至大鼠体内后,可迅速表现出明显的肺靶向聚集效应,但是其体内代谢也较快,注射后6 h便恢复至肺组织本底水平,可能主要通过肾脏排泄。5.放射损伤对LET-bFGF具有一定的趋化作用,可以增强LET-bFGF的肺靶向能力。6.在辐照后4 h时,凋亡主要发生于肺血管内皮细胞,在辐照后2个月时,凋亡可广泛发生于各种类型的细胞中,包括血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、间质细胞等,LET-bFGF可以抑制放射诱导的早期和远期肺血管内皮凋亡,其凋亡抑制效应优于bFGF。7.在辐照后2个月时,正常的肺泡结构被严重破坏,肺泡间隔明显增厚,大量的炎症细胞浸润,血管壁显著增厚,部分肺毛细血管可发生扩张和淤血,LET-bFGF可以降低肺血管壁的增生,缓解其他肺组织结构的紊乱,其保护效应优于bFGF。8.在辐照后2个月时,炎症细胞大量分布于肺间质与肺泡中,LET-bFGF可以降低放射诱导的肺部炎症,而bFGF则未观察到这种炎症抑制效应。9.在辐照后2个月时,肺部呈明显的纤维化,影像学表现为大量广泛分布的高密度影,肺平均密度显著升高,LET-bFGF可以减轻放射诱导的肺纤维化程度,而bFGF则未观察到这种纤维化抑制效应。结论:肺内皮细胞靶向肽LET修饰的bFGF具有较好的肺靶向能力,能够在RILI中发挥良好的修复作用。
【图文】：

序列,构建模式,重组蛋白

图 2-1 LET-bFGF 重组蛋白的构建模式图我们首先对实验室保存的 pET28a-bFGF 质粒进行了测序，从起始密码子 ATG 至终止密码子 TGA 共 528 个核苷酸，序列完全正确，见图 2-2。根据 linker 序列和肺靶向肽序列设计了 1 个上游序列和 2 个下游序列，共进行 2 次 PCR 扩增，然后通过双酶切、连接、转化、筛选等步骤，获得了含 pET28a-LET-bFGF 质粒的菌株，对其测序发现从起始密码子 ATG 至终止密码子 TGA 共 600 个核苷酸，序列完全正确，见图 2-3。

序列,表达质粒,测序,至终

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