骨骼肌挫伤修复过程中巨噬细胞的作用及机制研究

发布时间：2020-06-20 06:37

【摘要】：研究目的:巨噬细胞在骨骼肌损伤修复中起重要作用,但其作用机制尚不清楚。因而,我们构建骨骼肌钝挫伤模型,观察骨骼肌钝挫伤修复过程中促纤维化因子、肌再生因子、炎症因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的表达规律及肌纤维形态、再生肌纤维大小、胶原沉积情况,以阐明巨噬细胞在骨骼肌挫伤修复过程中的作用及作用机制。研究方法:将40只雄性C57BL/6小鼠(平均体重为21.3g,购买于上海杰思捷实验动物有限公司)随机分为两组:正常对照组(C,n=8),骨骼肌钝挫伤组(S,n=8),根据取材时间点的不同,钝挫伤组又可分为伤后3d,6d,12d和24d(每个时间点均为8只)。骨骼肌挫伤后3d,6d,12d,24d取双侧腓肠肌。HE染色观察骨骼肌再生肌纤维形态,Masson三色染色观察挫伤骨骼肌胶原沉积情况以及荧光定量PCR测定促纤维化因子、肌再生因子、炎症因子、趋化因子、基质金属蛋白酶基因表达变化。研究结果:1.骨骼肌钝挫伤修复过程中再生肌纤维形态及细胞标记物表达变化HE染色结果显示,骨骼肌钝挫伤后肌纤维结构破坏,大量肌纤维肿胀,坏死(伤后第3d),损伤后第6d和第12d出现大量再生肌纤维,中央成核肌纤维数量增加,伤后第24d,中央成核肌纤维数量减少,细胞核开始从中央向边缘移动。MyoD和myogenin是肌卫星细胞增殖、分化的标记物,荧光定量PCR结果显示,骨骼肌钝挫伤后第3d和第6d MyoD和myogenin mRNA表达水平显著高于对照组(p0.01),伤后第3d达到峰值,伤后3d至24d其表达呈下降趋势,24d时基本恢复到对照组水平。2.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中纤维化情况masson三色染色结果显示,与正常对照组相比,伤后第12d,大量的蓝色胶原纤维包围在新生肌纤维周围,伤后第24d,蓝色纤维化区域有所减少,但与12d相比,并没有显著下降(p0.05)。PCR结果显示,促纤维化因子TGF-β1 mRNA在钝挫伤后3d、6d、12d表达均显著高于对照组水平(p0.01),伤后第3d达到峰值,伤后第3d至伤后24d呈下降趋势。而TGF-β家族的另一个成员myostatin在钝挫伤骨骼肌修复过程中的表达水平没有显著性差异。3.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中巨噬细胞标记物表达情况荧光定量PCR结果表明,伤后第3d至伤后第6d,M1巨噬细胞标记物CD68、M2巨噬细胞标记物CD163和CD206 mRNA表达水平均显著高于对照组(p0.01),CD68 mRNA表达量在伤后第3d达到峰值,伤后第3d到24d其表达量呈下降趋势;而CD163和CD206 mRNA表达量在伤后第6d达到峰值,伤后第6d到伤后第24d其表达呈下降趋势,伤后24d基本恢复到对照组水平。4.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中肌再生因子表达情况对骨骼肌钝挫伤修复过程中肌再生因子进行PCR检测,结果发现,IGF-1和MGF mRNA在伤后第6d达到峰值(p0.01),随后其表达呈下降趋势,但其在伤后第12d表达量仍显著高于正常对照组(p0.05)。HGF、uPA、COX-2也是重要的肌再生因子,与对照组相比,它们在伤后第3d和第6d的表达均显著增加(p0.01),且在第3d达到峰值,伤后第3d到24d,它们的表达水平呈下降趋势,24d时基本恢复到对照组水平。5.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中炎症因子表达情况荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,骨骼肌挫伤组炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、TWEAK、fn14、IL-10)在损伤后3d、6d显著升高(p0.01),IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、fn14 mRNA表达水平在伤后第3d达到峰值,伤后第3d至伤后第24d其表达呈下降趋势,TWEAK、IL-10基因表达在伤后第6d达到峰值,随后下降,24 d时基本恢复到正常水平。6.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中趋化因子表达情况荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,钝挫伤骨骼肌中趋化因子(CCL2、CCR2、CXCR4)在损伤后第3d表达显著上调(p0.01),且达到峰值,CCL5 mRNA表达水平在挫伤后第6d达到峰值,伤后第6d至伤后第12d呈下降趋势,24d时基本恢复到对照组水平。7.骨骼肌钝挫伤再生修复过程中基质金属蛋白酶表达情况荧光定量PCR结果表明,基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-10 mRNA表达量在损伤后第6d达到峰值(p0.01),伤后第6d至12d其表达呈下降趋势,但MMP-2和MMP-10 mRNA在伤后第3d和第12d的表达量仍显著高于对照组。8.巨噬细胞特异标记物与促纤维化因子、肌再生因子、炎症因子、趋化因子及基质金属蛋白酶之间的联系皮尔逊相关分析结果表明,M1巨噬细胞(CD68)与肌再生因子(HGF、uPA、COX-2)、炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ、IL-10、TWEAK)、促纤维化因子(TGF-β1)、趋化因子(CCL2、CCR2)具有显著相关性,M2巨噬细胞(CD163)与炎症因子(IL-10、fn14)、肌再生因子(COX-2)、基质金属蛋白酶(MMP-10)相关,M2巨噬细胞(CD206)与肌再生因子(IGF-1、MGF、COX-2)、趋化因子(CCL5)、基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)具有显著相关性。结论1.骨骼肌钝挫伤修复过程中,促纤维化因子、肌再生因子、炎症因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的表达均出现显著变化,这表明它们可能在骨骼肌钝挫伤修复中发挥重要作用。2.巨噬细胞在骨骼肌再生中发挥关键作用,其机制可能是通过调节或分泌促纤维化因子、肌再生因子、炎症因子、趋化因子及基质金属蛋白酶参与损伤骨骼肌修复。
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R873
【图文】：

钝挫伤,骨骼肌,腓肠肌,HE染色

骨骼肌挫伤修复过程中巨噬细胞的作用及机制研究3.3 统计学分析实验结果采用 SPSS 22.0 软件处理，结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析对基因表达数据进行统计，并对组间均数的差异进行比较。p<0.05 表示显著性差异，p<0.01 表示非常显著性差异。4.实验结果4.1 骨骼肌钝挫伤修复过程中再生肌纤维大小及细胞标记物表达变化

肌卫星细胞,对照组,肌纤维,钝挫伤

发挥其吞噬功能并分泌细胞因子，部分区域嗜酸性增强，胞质颜色加深；伤后第6d，炎性细胞浸润减少，损伤组织被吞噬，肌卫星细胞受生长因子及损伤肌肉释放信号的刺激而活化，迁移到损伤部位进行增殖、延伸，形成单核或多核肌管细胞[3]，但再生肌纤维数量仍较少，直径较小；伤后第 12d，再生肌纤维体积进一步增加，中央成核肌纤维数量增加，部分再生肌细胞成熟；伤后第 24d，细胞排列紧密，边界清晰，多核肌管细胞数量进一步增多，细胞核偏离细胞中央向边缘移动，新生肌纤维成熟，标志着钝挫伤骨骼肌修复基本完成。另外，我们借助荧光定量 PCR 技术对骨骼肌钝挫伤修复过程中的肌纤维再生标记物进行检测，与正常对照组相比，MyoD mRNA（肌卫星细胞增殖标记物）表达水平在伤后第 3d、第 6d 显著增加（p<0.01），伤后第 3d 达到峰值，伤后第3d 至 24d，其表达呈下降趋势，钝挫伤后第 24d 时基本恢复到对照组水平，肌卫星细胞可分化为成肌细胞参与损伤修复，myogenin mRNA 表达情况可反映肌卫星细胞分化。本研究发现 myogenin mRNA 在挫伤后第 3d 的表达量显著高于对照组（p<0.01），伤后 3d 至 24d 呈下降趋势，但其在第 6d 的表达仍高于正常对照组（p<0.05）。

【参考文献】