基于定量蛋白组学方法的脑外伤后潜在生物标志物的筛选与验证

发布时间：2020-06-28 16:45

【摘要】：目的:脑外伤是指由于外力直接作用于头部所造成的损伤,脑外伤发病率逐年增加,致死及致残率极高。脑外伤发生后,由脑部损伤组织生理生化代谢的改变所引起的继发性损伤成为大脑功能缺损的主要原因。在临床中,脑外伤的诊断多基于CT、MRI等影像学方法,而缺乏相应的生化指标,故在脑外伤的治疗过程中难以进行综合性动态评价。此外,部分脑外伤患者所出现的精神及神经系统后遗症的发病机制仍然不明确。本研究拟通过定量蛋白质组学和生物信息学,全面分析脑外伤后代谢通路的变化情况,进而初步筛选脑外伤后的潜在生物标志物,探讨代谢通路变化与脑损伤的关系,也为脑外伤损伤时间推断提供技术手段。方法:本研究采用重物自由落体撞击SD大鼠大脑皮质的方式建立TBI动物模型。为探讨脑外伤后不同时间点蛋白组学的变化情况,分别在脑外伤后1 h、6 h、24h、3 d处死大鼠,并收集损伤组织周围的皮质。通过高分辨LC-MS/MS,分别对不同损伤时间点的皮质和对照组皮质进行定量蛋白组学分析。检测到的每一个蛋白质根据损伤组/对照组的比值大小筛选差异蛋白,以倍数大于1.2或倍数小于0.8作为差异蛋白的阈进行筛选。在此基础上通过DAVID,Pather Database等数据库进行生物信息学分析,获得Gene Ontology(GO)、Pathways的分析结果,根据生物信息学分析情况筛选差异蛋白作为潜在的生物标志物,并进行可靠性验证。同时,根据Pathways分析结果,探讨代谢通路变化与脑外伤后凋亡的关系,深入分析脑外伤后脑功能障碍的可能机制。结果:脑外伤后,损伤区脑组织蛋白表达发生显著变化,不同时间点差异蛋白参与到急性期应答、氧转运等生物学过程。在生物信息学对Pathways分析的基础上,筛选出泛素蛋白酶体途径、糖酵解途径以及Wnt信号通路作为研究分析对象,结合差异蛋白表达情况从而确定了PSMC4在损伤1h时表达量增加,第3天恢复正常;Hexokinase-1在脑外伤后1h表达增加,持续到第3天后逐渐降低;AP2M1前3天无显著变化,第3天开始降低。对代谢通路与脑外伤后凋亡的研究情况来看,脑外伤后凋亡抑制蛋白bcl-2表达降低,促凋亡蛋白caspase-3表达增加,同时Wnt信号通路关键蛋白β-catenin表达降低,通路受到抑制;当激活Wnt通路后,外伤后凋亡的激活被抑制。结论:脑外伤后,蛋白质组学轮廓发生显著改变,差异蛋白影响多个生物学过程以及多条代谢途径;PSMC4、Hexokinase-1、AP2M1,可以作为初步筛选脑外伤急性期(≤3 d)的潜在生物标志物;激活Wnt通路可以抑制损伤后神经元的凋亡。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：D919
【图文】：

实验流程,蛋白,三次,损伤时间

得到定量信息（图 2-1）；脑外伤 6h 后，三次生物学重复共鉴定到 1002 个蛋白，881个被定量（图 2-2）；损伤 24h 后，鉴定到 933 个蛋白，其中 832 有定量信息（图 2-3）；外伤 3d 后共鉴定 1216 个蛋白，定量蛋白有 1057 个（图 2-4）。根据已有文献的筛选标准，对蛋白组学差异蛋白进行筛选，以 TMT-127/TMT-126(损伤组/对照组)变化量≥1.2 倍或≤0.8 倍作为差异蛋白的选阈值，超过其范围，则认为脑外伤后这类蛋白的表达发生变化。对每一个损伤时间点的三次生物学重复，按下列原则对差异蛋白进行筛选：1. 三次定量结果中，TMT-127/TMT-126 比值均≥1.2 或≤0.8；2. 三次定量结果中，TMT-127/TMT-126 比值有两次≥1.2 或≤0.8；满足以上两个条件，则作为该损伤时间点的差异蛋白。对于差异蛋白，1h、6h、24h、3d 分别筛选出 173，147，283，255 个蛋白作为差异蛋白，上调和下调情况见图 3。

脑外伤,生物标志物,蛋白

脑外伤1h后，蛋白定性与定量结果

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