应用FTIR-mapping技术检测弥漫性轴索损伤的实验研究

发布时间：2020-07-03 21:52

【摘要】：背景:在临床医学、法医学等领域,对弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)的诊疗与鉴定都是核心工作及研究热点。对于DAI发生后存活时间较短的案例,更需要能够及早发现病因、客观表征病变、准确剖析病理。本研究旨在探寻利用傅里叶变换红外光谱逐点扫描面成像技术(Fourier transform infrared spectroscopy mapping,FTIR-mapping)检测DAI的特异性光谱指标,从化学键的红外光谱角度探讨DAI的病理改变,并尝试建立一种更为直观、准确、灵敏的DAI法医病理学检测方法。在当前的实际工作中,尤其在法医学鉴定上,研究人员对DAI的认定主要通过观察大体标本、组织切片,对损伤病变从宏观到微观进行综合判断。由于DAI的病理改变在形态学上呈现得往往较为复杂,这对全面认识病变,准确判断损伤部位与程度提出了较高的技术要求。一方面是制作组织切片与组织染色要求高。要观察DAI后轴索的形态学改变,或检测DAI引起的一些生物学标志物的表达改变,主要利用免疫组织化学染色、银染等在亚细胞水平进行的检测方法。这些方法的高准确度一定程度上依赖检材的科学取样、切片的标准制作及染色过程的精细操作,这需要经验丰富的技术人员来完成。另一方面是镜下图像分析水平要求高。在显微镜下分析切片的染色情况,判断染色阳性强度,是一种较为主观的组织病理学查验过程。若经验不足就常常难以准确地辨识和认定轻度改变或微小病变。另外,传统方法在用于诊断DAI时自身存在不足之处。譬如,各种生物标志物经免疫组织化学染色后,可能显示出轴索断裂,但不能表明系原发性还是继发性,而且倘若轴索尚未出现明显形态改变,标志物则不能呈阳性表达表现,无法发挥出诊断价值。每次免疫组织化学染色只能对单一某项生物学标志物进行分析,不能同时联用标志物体系加以诊断。银染法对急性期DAI的轴索损伤也不能及时反映。因此,本研究计划通过动物实验,利用FTIR-mapping技术,打破依赖轴索形态诊断DAI的局限性,探索一种能快速、准确地从分子层面检测DAI的方法,服务法医病理学司法鉴定工作。神经细胞具有细胞膜、细胞质、细胞核等结构,其化学组分的物理性质在不同部位展现出不同特点。许多疾病、损伤的发生发展,会引起组织成分发生不同变化,并可以表现出红外光谱的差异。红外光谱与其它分子光谱类似,能辅助确定分子组成、空间结构。FTIR是将干涉图经傅里叶转换所形成的红外光谱,既可以用于定性分析,又可以用于定量分析,还可以对未知物质进行解读。红外吸收峰的位置、形状及强度,都透露了未知分子的功能基团构成,甚至组成的化学结构。FTIR技术在样品制备、检测操作、数据分析、经济效益等方面都具有显著优势,检测限低、适用范围广,在化工、医药、珠宝鉴定、法庭科学等诸多领域都有所应用。利用FTIR技术检测DAI分子变化,目前报道极少,而利用面成像(mapping)技术对DAI的分子特征进行测定,目前只有杨天潼博士报道过蛋白酰胺Ⅱ带的检测成果。用FTIR-mapping技术探索DAI的分子特征,不仅可以了解分子振动模式、基本基团组成,还可以绘制2D、3D化学图像,通过红、黄、绿等色彩差异表现蛋白质、核酸等分子基团的含量与分布,与特殊染色的病理组织切片相对应。本研究属于化学技术与法医病理学、神经科学的交叉性创新研究。目的:建立大鼠DAI模型,观察大鼠伤后神经行为反应,研究DAI大鼠脑组织β-APP特殊染色、GFAP特殊染色的特征;研究大鼠脑损伤后DAI病变发生发展过程,通过FTIR显微镜检测DAI大鼠脑白质化学物质成分,寻找特异性红外光谱指标;研讨mapping图像与组织病理之间的对应关系,提炼有价值的数据结果,为将来应用FTIR-mapping技术在分子层面上鉴定DAI打下基础。方法:实验材料及仪器SD大鼠;落体打击装置;傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet TM 7500-Ⅱ)及显微镜附件;红外光谱工作站(OMNIC 6.0);虚拟显微成像系统(Dotslide 2.1);脱水机、包埋机、切片机、展片机、烤片机等;苏木素、伊红、天然树胶、二甲苯、乙醇、氨水、硝酸银等。研究方法及实验手段实验第一部分:建立轴索损伤模型。选取雌雄不限的SD大鼠共24只,按随机抽样原则分为2组,每组12只,建立Marmarou打击负荷损伤模型,落体打击后24h处死大鼠取脑。对照组只采取手术,不进行打击,直接处死取脑。实验第二部分:对各组别脑组织进行红外光谱、生物学标志物检测,并进行数据分析。(1)对样本脑组织切片进行FTIR红外光谱逐点扫描,绘制mapping图像:(2)将连续切片的脑片进行β-APP染色,从组织病理学上确认轴索损伤区域,提取损伤区域内光谱信息,进行定量、定性数据分析,筛选出DAI特异性红外光谱参数。结果:经FTIR-mapping检测,实验组的蛋白质仲胺N-H伸缩振动、胶原蛋白三螺旋结构的高吸收区与β-APP验证的DAI区相符合,与低吸收区域相比,高吸收区吸收度差异性极其显著(P0.05),二者光谱高低吸收区的吸收度比率分别较对照组明显增高;蛋白质中CH_3对称收缩、核酸和磷酸脂质PO_2对称伸缩振动的吸收度与验证组差异性不显著(P0.05)。FTIR-mapping的逐点扫描面成像技术绘制的化学图像基本可以反映DAI各大分子分布特征,并且与β-APP验证的弥漫性轴索损伤区基本一致。结论:傅里叶变换红外(FTIR)显微光谱是从组织切片中获取化学信息的强大技术。红外光谱化学图像以色彩差的方式揭示基团分布情况,并与组织病理相对应一致。应用FTIR-mapping技术能直观表现DAI的分子特征,分析分子指标的变化,从分子振动模式、振动频率推测DAI的发展过程,从病理形态学角度诊断DAI病变的部位,并根据红外吸收度值的改变情况判断脑组织DAI的损伤程度。蛋白质仲胺N-H伸缩振动、胶原蛋白三螺旋结构可以作为诊断DAI的特征性红外指标。经过进一步深入研究,有望应用FTIR-mapping技术进行DAI病理学诊断。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：D919
【图文】：

碰撞项,头部运动,碰撞损伤,颞下颌关节

生物力学机制。（1）正向撞击。在交通事故中，由于紧急刹车或追尾车辆，驾驶人头部撞向前风挡玻璃或乘客头部撞向前排座椅都属于此种类型。当头部迎面撞击前方物体时，双侧大脑半球因惯性作用继续向前移动，双侧方牵拉可使胼胝体发生撕裂性轴索损伤。若一侧半球比另一侧位移较快，则胼胝体易发生偏心性出血，损伤常累及穹隆、扣带回、透明隔、尾状核头部和丘脑背侧等近中线组织结构。（2）暴力扭转。擒拿术中扭颈动作，做滚团动作时头部位置不正等情形，均可能导致 DAI。暴力扭转头部，大脑、小脑、脑干等各部位相连接处，由于组织密度差异，稳定性相对低，在外力拉伸过程中，位于交界区的小脑上脚背侧、导水管下端等最容易受到损害，同时其间穿插的神经纤维束也会发生轴索损伤。成角加速伤常常导致脑深部 DAI，表现为弥漫性脑白质变性，而无颅内血肿等局灶性病变。在不同剪切力下，肉眼或 CT 检查可见灰质白质交汇区、基底节区轴索损伤，并可伴有毛细血管的撕裂、出血。

轴膜,轴突,细胞外液,内流

头部瞬时加速或减速时产生脑内创伤性剪切力，可以牵其通透性及运输物质的功能，出现轴索转运障碍（impaired axonal DAI 逐步进展。这种剪切力可能发生在道路交通事故、跌倒及暴力]，也可能是由于虐待儿童的结果[6]，如摇婴综合征等。从损伤发生机制看，DAI 轴索断裂可为原发性，也可为继发性[7、8]，可以观察到轴突的完全离断，但 DAI 的主要损害是在时间延续过性轴突断裂[9]。虽然涉及继发性脑损伤的详细病理生理机制仍不清楚伤过程中拉伸轴突会引起细胞骨架的物理破坏和蛋白质水解降解。当轴索遭受外力损害时，轴膜通透性明显增高，在轴突中开放钠离门控钙通道打开，Ca2 +流入细胞[2]。Ca2+存于细胞将启动几种不同关蛋白酶或蛋白激酶去磷酸化[10]，破坏线粒体和细胞骨架，使得神轴浆运输密切相关的细胞骨架结构重排或水解[11、12]，激活第二信使离和细胞死亡[13]。这种继发性损伤为非离断性轴索损伤。

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