大鼠磷化物中毒检测及组织病理学观察

发布时间：2020-07-19 09:12

【摘要】：目的:磷化物主要包括磷化锌、磷化铝、磷化钙和磷化镁,农业领域常用于保护食品不受啮齿类动物和昆虫的侵害,也用于列车车厢、船舱和储存库的熏蒸消毒,是全球最普遍的杀鼠、杀虫剂。工业领域则用于石油添加剂、阻燃剂和有机磷化工合成以及半导体制造中硅晶体的涂层。磷化物遇水或酸可以产生无色稍有鱼腥臭味的高毒类磷化氢气体,口服无机磷化物或误吸磷化氢中毒致死事件在国内外时有发生。由于磷化氢中毒的毒理作用机制尚未完全被阐明,中毒后主要组织病理学变化多样,缺乏典型组织病理学改变,以及不属于常规毒物筛查范围,对于磷化物中毒致死案例的死因鉴定一直是法医学鉴定的难点。法医学对于磷化物中毒的检测和组织病理学观察方面所作的基础研究探索工作甚少,本研究通过建立大鼠急性磷化铝中毒灌胃模型,采用法医学经典磷化氢二乙基二硫代氨基甲酸银(Ag-DDC)比色法对染毒大鼠组织器官进行中毒检测,借鉴其他学科有关磷化氢钼蓝比色法检测方法原理将其引入并对比法医学检测方法,探索和优化常见生物检材中磷化氢检测分析方法,丰富法医学磷化氢检测研究。同时对染毒大鼠器官组织进行组织病理学观察,研究磷化铝灌胃中毒模式下器官组织病理形态学改变,寻找较典型的组织病理形态学改变,进一步探讨磷化氢中毒的毒理作用机制。方法:1.选用健康清洁雄性SD大鼠24只,由河南科技大学动物实验中心提供,体重(270±40)g。实验前隔夜禁食,24只大鼠随机分为实验组(12只)和对照组(12只)。实验组以食用油包裹碾成粉末状磷化铝6LD_(50)(6×11.59mg/kg)经口进行灌胃,观察记录中毒症状,死亡时间。对照组灌服等量食用油,观察24h无明显症状变化后颈椎脱臼处死,当实验组和对照组大鼠的呼吸和心跳等生命体征全部消失时,迅速解剖动物,取大鼠部分肺、肝、肾、肌肉、睾丸等经福尔马林固定后,HE染色制片观察;另取心血、心脏、肺、肝、脾、肾、脑、胃及胃内容物密封袋密封置于-20℃冰箱内保存待检。2.健康清洁雄性SD大鼠40只,体质量(250±30)g,由河南科技大学动物实验中心提供。随机分为3个实验组和1个对照组,每组各10只,分笼饲养。各组大鼠实验前隔夜禁食,实验开始后先将磷化铝片剂装入密封袋中敲打碾磨成细粉状,大鼠称重后按照文献所报道的大鼠口服磷化铝灌胃LD_(50)为11.59 mg/kg进行给药量计算,实验组大鼠分别以5ml食用油包裹碾成粉末状的磷化铝经口一次性灌服0.5、1.0和2.0倍LD_(50)剂量,对照组大鼠则灌服5ml等体积食用油。观察大鼠经实验干预后的行为表现,记录各组大鼠死亡时间及数量,未死亡大鼠连续观察14 d后颈椎脱臼法处死。取肺、肝、肾、脾、心脏、脑、睾丸、肌肉、喉头、气管、胃及胃内容物组织,经固定、漂洗、后固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色等处理,光镜观察并显微照相。结果:1.钼蓝比色法检测生物检材中的磷化氢,在5~25μg范围内可用于定量检测,检出限为1.8μg,回收率78.00±2.83~92.68±2.28%,方法精密度达1.47~4.69%。传统法医学Ag-DDC比色法在10~45μg范围内可用于生物检材中的磷化氢定量检测,检出限为10μg。2.钼蓝比色法检测结果与传统法医学Ag-DDC比色法进行比较,发现两种方法对于心血、胃及胃内容物检出定量结果无显著性差别(P0.05),肺、肝、脾、肾、脑组织中均可检出磷化氢但不能进行定量,心脏中均未检出磷化氢。3.急性大鼠磷化铝灌胃染毒后四组大鼠的死亡率随着染毒剂量的增加而升高(P0.05)。大鼠染毒后平均死亡时间随着染毒剂量的增加而减小(P0.05),但减小幅度在逐渐趋于稳定。4.光镜观察结果:0.5倍LD_(50)死亡组肺组织肺泡腔内可见弥漫性出血,肺泡壁毛细血管及肺内小动脉扩张、充血明显,间质上皮细胞增生,肺泡间隔明显增宽;0.5倍LD_(50)未死亡组肺组织肺泡腔内弥漫性出血现象消失,肺泡壁毛细血管及肺内小动脉扩张、充血现象消失或不明显,间质上皮细胞增生,肺泡间隔增宽;1.0倍LD_(50)组肺组织局部肺泡壁断裂、融合,肺内小血管及间质毛细血管充血、扩张,肺泡间隔稍增厚;2.0倍LD_(50)组肺组织可见局部肺泡壁断裂、融合,肺内小血管及间质毛细血管轻度充血、扩张,肺泡间隔略增厚;肝细胞脂肪变性,散在灶性水样变性及点灶性坏死,局部肝门管区可见以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润;脑组织水肿,脑血管周围有淋巴细胞和胶质细胞聚集、渗出,包绕血管形成血管套;心肌间质疏松,心肌细胞肿胀,胞质疏松淡染,部分心肌润盘及横纹结构模糊;胃黏膜局部可见腺体破坏或减少;生精上皮脱落分离、变薄,生精细胞排列紊乱。结论:1.磷化铝片剂暴露在空气中不稳定,易与空气中水分接触释放出磷化氢气体,造成片剂成分比例改变及周围环境气体污染。本实验采用将磷化铝片剂经密封袋中碾磨成粉剂后,再称取一定量的粉剂溶入食用油中对动物进行灌胃,该方法能够有效减少实验过程中磷化铝在空气中暴露的时间,达到控制实验变量及增强实验室安全的效果,可为磷化氢中毒检测动物模型制备提供参考。2.钼蓝比色法达到了生物检材中毒物检测的要求,具有操作简便、快速、定性定量较准确的特点,同时相比于Ag-DDC吡啶法中吡啶恶臭味、吸入过多对人体健康产生危害,钼蓝比色法更加安全环保,检测限有所提高。适用于磷化氢含量较高定性定量检测,满足教学实验需求,为丰富法医学磷化氢化学检测技术提供参考。3.本次实验采用食用油包裹磷化铝粉剂灌胃的方法成功建立了急性大鼠磷化铝灌胃染毒组织病理学观察动物模型,动物染毒后组织病理学改变观察清晰明显,具有针对性强、安全便捷、可行性高等特点,可为未来口服磷化铝中毒的相关研究奠定动物实验基础。食用油对于口服磷化铝中毒早期催吐治疗可能会具有一定的疗效,起到隔离胃酸,减缓磷化铝遇胃酸释放磷化氢时间的作用。4.急性大鼠磷化铝灌胃染毒大鼠可引起肺、肝、脑、心脏、胃肠、睾丸多器官组织病理学改变,尤其是对肺部损伤改变明显,以肺出血、肺泡壁增厚(毛细血管充血、间质上皮细胞增生)、局部肺泡壁断裂及融合为主要病理变化,并表现出中高剂量染毒组以肺充血、肺泡壁稍增厚、局部肺泡壁断裂及融合为主要肺部表现,低剂量染毒组以肺出血、肺泡壁增厚为主要肺部表现,染毒死亡各组大鼠肺充血、出血,肺泡壁增厚现象与染毒剂量之间呈负相关,即染毒死亡组存活时间越长肺部病理改变现象越明显。5.本实验关于肺泡壁增厚现象(间质上皮细胞增生)在一定程度上揭示了磷化氢中毒的部分机制,肺的间质上皮细胞增生是肺部中毒性损伤适应性、普遍性、非特异性的组织修复反应,是一种氧化应激性作用下的肺对于中毒损害的防御,染毒后存活大鼠遗留有肺泡壁增厚不可逆性损伤,而肺充血、出血现象消失。证明了磷化氢能够通过氧化应激机制发挥毒性损害,产生肺部不可逆性间质上皮细胞增生损伤现象。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：D919

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