亲水基团修饰靶向GPC3受体的新型分子探针的构建及PET显像研究

发布时间：2020-07-22 19:06

【摘要】：研究背景:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员,特异性的高表达在80%以上的人肝癌组织中,而非肝癌组织不表达。L5(序列为RLNVGGTYFLTTRQ)是韩国学者Lee等经噬菌体展示及转染技术筛选出来的GPC3受体的特异靶向多肽。近几年,我们研究团队开发了 18F标记的L5显像剂用于荷瘤裸鼠HCC成像,然而,肝脏及肠道聚集了大量的放射性显像剂,其图像质量并不是很好,不利于肝脏和腹部肿瘤的显像。为了提高显像效果,我们在前期研究的基础上,对NOTA-L5进行修饰,在靶向多肽NOTA-L5的-NH2端增加了亲水基团GGGRDN(简称L),制备了 18F标记的18F-AlF-NOTA-L-L5,期望亲水基团的引入能提高探针的水溶性,减少肝胆排泄,降低肝脏和肠道的放射性背景,更有利于肝细胞癌的显像。研究目的:1.通过将GGGRDN(L)的亲水性基团修饰NOTA-L5多肽并使用18F-AlF螯合法进行放射性标记开发新型的GPC3靶向PET探针(18F-AlF-NOTA-L-L5)。2.与18F-AlF-NOTA-L5进行比较,探索亲水基团L的引入后的靶向探针18F-AlF-NOTA-L-L5能否减少肝胆排泄,降低肝和肠中的背景放射性,提高肿瘤显像效果。研究方法:1.合成L5、L-L5、NOTA-L5及NOTA-L-L5,并对多肽进行分离纯化及分析鉴定。2.用表面等离子共振(SPR)测量来确定NOTA-L5和NOTA-L-L5对GPC3蛋白的亲和力。3.采用手动和模块化通过18F-AlF螯合法标记得到放射性标记探针18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5,并测定各自的标记率和放化纯度。4.用HPLC对18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5放射性药物进行体外稳定性实验,使用Y计数器对上述放射性药物进行体内稳定性实验及脂水分配系数实验。5.体外细胞摄取及流出实验用于评价18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5与受体GPC3的结合特性。6.建立HepG2及RH7777裸鼠肿瘤模型,经尾静脉注射18F-AlF-NOTA-L5或18F-AlF-NOTA-L-L5,并研究该肿瘤模型的microPET/CT显像及裸鼠的体内分布。7.通过对HepG2及RH7777肿瘤组织行免疫病理检查确认其GPC3表达。结果:1.合成多肽L5、L-L5、NOTA-L5和NOTA-L-L5,纯度均大于95%。质谱分析主峰分子量与理论分子量相符,满足实验要求。2.亲和力实验:用表面等离子体共振(SPR)测定法测定NOTA-L5和NOTA-L-L5与GPC3结合能力,结果显示:NOTA-L5和NOTA-L-L5的解离常数(KD)分别为1.01×10-7和6.33×10-8mol。两者的Kd都在纳摩尔级别,提示亲水基团修饰对亲和力无明显影响。3.18F-AlF-NOTA-L5 和18F-AlF-NOTA-L-L5 合成产率分别为 79.98±8.04%和54.81±9.05%,18F-AlF-NOTA-L-L5 标记产率低于 18F-AlF-NOTA-L5(P0.05)。经C18柱纯化后其放化纯度分别为97.17±1.03%和100±0%,两者的放化纯度差异有统计学意义(P0.05)。产物峰单一,与未标记前的多肽出峰位置基本相同。4.稳定性试验:18F-AlF-NOTA-L5在37℃ PBS及血清中的放化纯度均大于94%,18F-AlF-NOTA-L-L5在37℃ PBS及血清中的放化纯度均大于98%,18F-AlF-NOTA-L-L5 体外稳定性优于 18F-AlF-NOTA-L5(P0.05)。在注射18F-AlF-NOTA-L5 60 分钟后,18F-AlF-NOTA-L5 及 18F-AlF-NOTA-L-L5 的体内稳定未见明显差异(P0.05)。5.脂水分配实验:经实验测定18F-AlF-NOTA-L5的Log P=-2.10±0.07,18F-AlF-NOTA-L-L5的Log P=-2.42±0.09,两者之间的统计学分析表明18F-AlF-NOTA-L-L5 分子探针亲水性比 18F-AlF-NOTA-L5 好(t=5.482,P=0.002,n=4)。6.体外细胞摄取实验:HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L-L5及18F-AlF-NOTA-L5两种示踪剂曲线相似,HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L-L5稍高于18F-AlF-NOTA-L5,但是两者差别不大。HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5明显高于GPC3阴性的RH7777细胞。HepG2细胞与两种放射性药物共同孵育30min后,HepG2细胞结合放射活性接近高峰,并达到平台期。7.micro PET/CT 显像:注射 18F-AlF-NOTA-L5 或 18F-AlF-NOTA-L-L5 后,18F-AlF-NOTA-L-L5 的 HepG2 肿瘤摄取显著高于 18F-AlF-NOTA-L5(30min:3.10±0.26vs2.28±0.33,t=3.935,P = 0.008;60min:3.27±0.34vs1.90±0.65,t =3.757,P = 0.016),120min 18F-AlF-NOTA-L-L5 肿瘤摄取为 1.35±0.17%ID/g 稍高于18F-AlF-NOTA-L5 肿瘤摄取(1.08±0.73%ID/g),差异没有统计学意义(t=0.730,P=0.493)。注射18F-AlF-NOTA-L-L5 30min、60min及120min后,不表达GPC3 RH7777肿瘤几乎不摄取,HepG2肿瘤摄取在不同时间的均显著高于RH7777肿瘤摄取(30min:3.10±0.26vs1.75±0.04,t =10.308,P=0.002;60min:3.27±0.34vs1.63±0.03,t =9.639,P = 0.002;120min:1.35±0.17vs0.66-±0.05,t =7.693,P = 0.003)。18F-AlF-NOTA-L5 在 30min、60min、120min 肝脏摄取值高于18F-AlF-NOTA-L-L5 肝脏摄取值,并且 30 及 60min 18F-AlF-NOTA-L-L5 肝脏摄取值显著低于18F-AlF-NOTA-L5肝脏摄取,差异具有统计学意义(30min:6.35±2.54vs1.93±0.39,t=3.449,P=0.038;60min:4.32±1.49vs1.85±0.37,t=3.232,P=0.041;120min:2.30±0.21v51.23±0.43,t=2.118,P=0.079)。18F-AlF-NOTA-L-L5的肾脏摄取值都明显高于18F-AlF-NOTA-L5的肾脏摄取值,差异都具有统计学意义(30min:37.55±3.79vs12.83±1.65,t=6.426,P= 0.001;60min:35.9±2.56vs8.70±1.70,t =11.798,P = 0.000;120min:31.86±3.8vs2.57±0.17,t=4.224,P = 0.006)。对不同时间点的不同脏器进行了肿瘤/非肿瘤放射性比值分析,结果显示:在HepG2裸鼠肿瘤模型中,18F-AlF-NOTA-L-L5的肿瘤/肝脏摄取比值在30min、60min及120min都高于18F-AlF-NOTA-L5的肿瘤/肝脏摄取比值,差异都具有统计学意义(30min:1.65±0.28vs0.39±0.11,t =8.314,P = 0.000;60min:1.82±0.38vs0.48±0.23,t =6.068,P = 0.001;120min:1.17±0.31vs0.49±0.39,t =2.740,P=0.034)。注射靶向分子探针后,18F-AlF-NOTA-L-L5在30min及60min具有比18F-AlF-NOTA-L5更高肿瘤/肠道,差异有统计学意义(30min:2.70±1.19vs0.64±0.35,t =3.324,P = 0.016;60min:2.74±0.44vs0.71±0.53,t =5.863,P = 0.001;120min:3.45±2.15vs0.39±0.19,t=2.842,P = 0.064)。体外生物学分布实验结果与小动物microPET结果相似。8.免疫组化结果显示GPC3在HepG2肿瘤组织高表达,在RH7777肿瘤组织中不表达。结论1.本研究通过 A118F 螯合法成功制备了 18F-AlF-NOTA-L5 和 18F-AlF-NOTA-L-L5,其放化纯达97%以上。此A118F-NOTA螫合化学方法简便、省时,可通过“一锅法”标记完成,并同时能进行模块式自动化生产,为临床大批量生产提供可能。此实验表明:亲水基团修饰NOTA-L5肽后,18F-AlF-NOTA-L-L5放射性标记效率低于18F-AlF-NOTA-L5放射性标记效率,但是其放化纯度高于18F-AlF-NOTA-L5。2.以上实验证明:增加亲水基团GGGRDN后,不影响18F-AlF-NOTA-L-L5与GPC3结合能力,不影响18F-AlF-NOTA-L-L5体内外稳定性,且其亲水性明显提高。3.体外细胞摄取实验表明18F-AlF-NOTA-L-L5摄取均符合受体-配体竞争结合规律。4.经microPET/CT和体内放射性分布研究证实引入亲水基团后,肿瘤摄取提高了,肝胆排泄明显降低,肾脏摄取明显增高,肿瘤/肝比值明显增高,有利于肝细胞癌的显像。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R817
【图文】：

３．２邋ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５的合成方法学逡逑３．２．１逦ＮＯＴＡ－Ｌ５和ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５通过ｐ－ＮＣＳ－Ｂｎ－ＮＯＴＡ经由硫脲键与肽的胺基连逡逑接（图３－１）。逡逑Ｌ邋，．．一ｆ邋ｓ逦肽链逡逑》ｃ４ｓ逦Ｉｆ邋＇邋kw逦＾邋Ｈ逡逑°逦丨加热逡逑逦逦逦逦逡逑ｆＸ邋Ａ逦，佊佊二／ ？？0＊逡逑＇ＮＨ邋加热逦、逦ｓ３＾0逡逑ｄ＾－Ｒ邋＾逦＞＝＼逡逑＼１邋Ｈ逡逑苯乙内酸硫佭逡逑（ＰＴＨ邋｝逦ｋ＾Ｊ逡逑图３－１邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ５和Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５合成化学方程式。逡逑Ｆｉｇ邋３－１ＮＯＴＡ－Ｌ５邋ａｎｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｅｑｕａｔｉｏｎ．逡逑３．２．２逦ＮＯＴＡ－Ｌ５邋的合成逡逑准备两个１．５ｍｌ的编号分别为Ａ、Ｂ的离心管。用精密天平称取３．７ｍｇ多肽逡逑Ｌ５装至Ａ管，并加２００ｕｌ的硼酸缓冲液，超声震荡２分钟。称取２．０ｍｇ逡逑ｐ－ＮＣＳ－Ｂｎ－ＮＯＴＡ装至Ｂ管，溶解于ｌＯＯｕｌ邋ＤＭＳＯ，超声震荡２分钟。Ａ管及Ｂ逡逑管混合，将混合物的ｐＨ调节至９．０，在室温下超声２小时后，反应被淬灭。反逡逑应后取５ｕｌ样品，使用分析型ＨＰＬＣ来鉴定所需产物。分析型ＨＰＬＣ在Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ逡逑Ｌｕｎａ邋Ｃｉ８反相分析柱（５ｊａｍ，２５0ｘ４．６ｍｍ）上的参数为：流速为ｌｍＬ邋／邋ｍｉｎ，Ａ逡逑相为含０．１邋％三氟乙酸的水溶液、Ｂ相为含０．１邋％三氟乙酸的乙腈溶液

图３－２邋１８Ｆ标记Ｎ０ＴＡ－Ｌ５及Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５反应流程图。逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋１８Ｆ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ５邋ａｎｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｃｈｅｍｅ0逡逑３．４．３半自动化模块１８Ｆ－Ａ１Ｆ螯合法ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５逡逑Ｉ８Ｆ标记Ｎ０ＴＡ－Ｌ５及Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５在氟多功能模块（如下图）半自动合成。逡逑１）Ｃ１８柱的活化：使用注射器抽取无水乙醇１０ｍｌ，将Ｃ１８柱与注射器连接，推动逡逑注射器使无水乙醇通过Ｃｉ８柱，随后打入空气使Ｃｉ８柱干燥，另用注射器抽取１０ｍｌ逡逑纯水通过Ｃ１８柱，随后打入空气使其千燥，完成活化。２）模块的清洗：首先检逡逑查设备中的各个部件的功能状态，如密封性，滤片的过滤功能，管线是否完好逡逑及无折叠，气密性是否良好等。然后依次向试剂瓶１－６号瓶中先后加入５ｍｌ水，逡逑１７逡逑

质谱分析鉴定，ＮＯＴＡ邋－Ｌ５的主峰分子量（ｍ／ｚ，邋Ｄａ）为２０７６．３和２６３２．８，逡逑与ＮＯＴＡ邋－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５理论分子量２０７６．３７和２６３２．９１相符，证明标记合成逡逑（图５－３）。经ＨＰＬＣ纯化、分析结果显示，ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５标记多肽主逡逑峰明确，对称性良好，主峰保留时间分别为１４．５３３和１３．４７３ｍｉｎ。ＮＯＴＡ－Ｌ５的逡逑纯度为９６．２９％和９５．９７％邋（图５－４）。验证合格后将产物分装入２５０＾ｇ／管，清楚标逡逑识后放入－８０°Ｃ冰箱中存放。逡逑ｆ逦逦邋逦［苜逦逦逡逑Ｉ邋５Ｊｓ，逦Ａ邋！邮逦ＳｆＳ逦Ｂ逡逑Ｉ邋５Ｊ逦卜叫逡逑Ｉ逦！逡逑Ｍ逦ｊ邋Ｉ）逡逑ｆ逦Ｉ逡逑Ｈ逦Ｉ邋—逡逑ｉ逦ｆ逦Ｍｉ？｜逦：逦Ｉ逡逑１逦叫逡逑ａＳ．４ｐＨｒ．ＩＭｆ逦Ｕｔ／ｉ逦ｉ逦｜逡逑Ｓ２＊１‘逦ｉ逦丨邋‘逦｜邋ｉ逡逑Ｉｓ逦｜逦！逦ｉｓ逡逑Ｉ逦ｋ＾＼逦ｉ逦ｉ逦｜逡逑！！逦丨逦洁ｗ逡逑！逦卜逡逑；逦Ｉ逦Ｉ逦｜逦ｉ逦ｉ逡逑；Ｈ逦丨逦丨心逡逑Ｉ逦叫邋｜逦ｊ逦＾臂逡逑，鲈逦ｊ逦｜邋Ｕｒｆ｜逡逑Ｉ逦Ｉ逦丨逡逑卜？．逦？被逦Ｈ逦ｊ逦Ｉ逡逑Ｉ逦＼逦ｍｉ逦＼逡逑Ｉ邋＾逦＾邋｜邋ｊ邋＾逦ｊ逦Ｌｉ逦＾邋＾逡逑■．＾３？逦ｔ＆ｔ７ｊｉｇ：－ａｉ－：邋ｃ邋＾，ｉＴ？？逦ｊ邋ｊｇ；逦＾邋ｍ逦ｓａ＞逦？ｍｎｇａ邋ｉ逡逑＂￥ｃ逦？？铱邋ｉ？邋滚邋_炲迕藉澹觯�．邋ｒｘ邋ｍ邋ｒｉｓ邋＾ｓ．邋ａａ邋�

本文编号：2766230