DNA-PKcs在DNA损伤应答中的PAR修饰和乙酰化修饰研究

发布时间：2020-07-24 00:35

【摘要】：自然界中有多种环境因子,如紫外线、电离辐射和化学试剂等都会导致DNA发生损伤,包括碱基损伤、DNA加合物、DNA双链断裂、DNA单链断裂,最为严重的是DNA双链断裂(DSB),而电离辐射(IR)又是导致DNA双链断裂的重要因素,当使用IR诱导细胞发生DSB后,会有两种主要修复方法介入DNA损伤修复,划分为:非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR),NHEJ修复为易错修复,而后者修复较为精确。DNA-PKcs是DNA双链断裂修复过程中非常重要的蛋白质分子,它的翻译后修饰对其活性起着决定性的作用,目前在蛋白质翻译后修饰领域中有很多种,多聚ADP核糖基化(PAR)修饰与乙酰化修饰就是其中的两种,其在染色质重塑、DNA修复、基因转录、细胞凋亡和肿瘤发生中起着异常重要的作用。而且磷酸化也在DNA修复中起重要作用。目的:(1)研究DNA-PKcs的PAR修饰及其对DNA-PKcs功能和DNA损伤修复的影响。(2)探索DNA-PKcs的乙酰化修饰。方法:(1)通过将细胞进行照射和未照射后,采用免疫共沉淀(Co-IP),免疫共聚焦荧光(IF),免疫印迹(western blot),以及流式细胞仪等技术手段检测细胞DNA-PKcs的PAR修饰程度变化,不同周期DNA-PKcs的PAR修饰程度,应用聚ADP核糖基化(PARP)抑制剂Olaparib后对于DNA-PKcs的影响以及对于修复通路选择的影响,并研究其调节机制;细胞克隆实验验证Olaparib对于细胞的毒性作用,细胞生长曲线验证DMSO,Olaparib,Olaparib+DNA-PKcs抑制剂NU7441对于细胞的毒性作用;报告基因检测Olaparib处置后对修复通路的选择影响;单独或组合使用Olaparib和NU7441后检查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表达;单独或组合使用Olaparib和KU55933后检查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表达。(2)使用免疫共沉淀方法(Co-IP)验证DNA-PKcs的乙酰化修饰,并且将其与未照射组比较,验证照射后不同时间的乙酰化程度;通过周期阻滞,验证不同周期DNA-PKcs的乙酰化程度;ASEB网站中利用Tip60序列及功能特性预测DNA-PKcs可能的乙酰化位点;检测DNA-PKcs截短体中乙酰化发生的区段;质谱实验寻找DNA-PKcs可能的乙酰化位点。结果:(1照射后,DNA-PKcs发生PAR修饰,并且随着照射剂量的增加,PAR修饰的程度会越来越高;Olaparib处理后,在10μM的浓度下,PAR修饰减少明显;通过TDR周期阻滞后,显示在S期PAR修饰最强;Western和激光共聚焦显示Olaparib处理细胞后激活DNA-PKcs的S2056位点磷酸化;激活NHEJ修复通路,而且增加细胞的放射敏感性;Olaparib处理增加了ATM磷酸化状态。(2)DNA-PKcs能够发生乙酰化,且在S期乙酰化作用最强,在照射后随着时间的延长,乙酰化修饰也增强;ASEB网站预测出乙酰化位点为:K1917、K3650、K4004;质谱实验结果提示乙酰化位点为K1870。结论:(1)DNA-PKcs能够发生PAR修饰,并且PAR修饰随着照射剂量的增加而增加,且在S期最明显;Olaparib处置细胞后,激活DNA-PKcs和ATM活性;NHEJ修复通路激活;细胞的辐射敏感性增加。(2)DNA-PKcs可以发生乙酰化,随照射后时间延长而增强,并且在S期最明显;乙酰化的可能修饰位点为:K1870、K1917、K3650、K4004。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R818
【图文】：

种类,泛素化,翻译后修饰

DNA-PK 激酶发生活化，并且还在 DNA 双链断裂时调节自身的动力学[5]。翻译后修饰（Post-translational modifications ，PTMs)是蛋白质发生共价加工事件，其通过蛋白水解切割，或者通过向一个或者向多个氨基酸添加修饰基团从而改变蛋白质的特性。蛋白质的 PTM 不仅仅是“装潢”，还可以抉择其活性状况、定位、转换和与其他蛋白质的相互作用。例如，在信号传导中，通过可逆添加和去除磷酸基团来打开和关闭激酶级联反应[7]，并且在细胞周期中，蛋白质泛素化标记细胞周期蛋白在特定的时间点被破坏[8]。我们都知道人体中的氨基酸仅仅 20 种，能够合成的蛋白质也很少，所以要想满足机体的多种多样的功能，只有通过翻译后修饰才能达到此目的（图 1.2）。众所周知，PTM 如泛素化，去泛素化（neddylation），乙酰化和核糖基化（Parylation）等是调节细胞许多代谢过程的重要机制（图 1.1）。在我们的基因组中有许多的基因，通过基因的可变剪切、mRNA 编辑和可变启动子，就会形成大量转录基因组，通过翻译后修饰，就会产生超过约 1,000,000 的蛋白质，从而行使不同的功能。

蛋白组,复杂性,北京,核糖基化

图 1.2 蛋白组复杂性（引自北京百泰派克生物）聚（ADP-核糖基化），在 DNA 修复、复制、转录和细胞死亡凋亡中起关。自 1963 年以来已发现聚（ADP-核糖基化）反应已有 55 年，其发生 PA的氨基酸为丝氨酸。其中新的 DNA 依赖性聚腺苷酸（PAR）由 PARP 和单核苷酸（NAD）合成，PARG 水解 PAR[9,10]。将细胞置于电离辐射，自烷化剂等的环境后，PARP迅速与 DNA链断裂区结合，导致PAR 修饰，NA

结合因子,转录调节,信号传导,染色质

PARP的激活导致细胞PAR的大量增加，其被PARG快速分解代谢[20,21]，但是完全逆转需要TARG[22]或MacroD1 / 2活性[23-25]。 PARylation在DNA损伤反应中的作用可分为三个类别：松散染色质结构，PAR结合因子的募集和/或修饰以及转录调节[26]。染色质相关蛋白（包括组蛋白和PARP1本身）的PAR修饰促进了染色质松散，从而导致它们从DNA解离。 PAR结合因子主要通过四类PAR结合结构域之一募集：PAR结合基序（PBM），PAR结合锌指（PBZ），macrodomain和WWE结构域[27]。一些（例如ALC1，APLF，ISWI）参与染色质的重塑[28,29]。其他参与DNA修复（例如XRCC1，DNApol-β，MRN复合物，Topo I）[17,30-31]或广义DDR信号传导（例如p53）[32,33]。最后，转录调节主要涉及募集或修饰参与转录沉默的蛋白质（例如CHD4，PcG蛋白和FACT复合物）[34-36]，PAR介导的转录激活也发生在NFκB介导的炎症信号传导中[37]。然而，过度PARylation会导致细胞死亡，这样有助于通过牺牲严重受损细胞来维持生物体的基因组完整性[38]。

【相似文献】