高重力对成骨细胞与骨重建的影响及其机理研究

发布时间：2020-08-21 05:24

【摘要】：研究背景和目的:力学刺激同生物化学刺激均在细胞内触发各种胞内信号。目前,力学生物学成为研究流体静水压、压缩应力和拉伸应力等力学刺激对生物体影响的重要手段之一。力学刺激在骨重塑中起着重要作用。骨组织细胞在体内的应力作用下分化、增殖并成熟,并对应力刺激极为敏感。体外培养的工程骨组织往往不能提供足够的组织结构和力学性能,这在很大程度上归因于细胞培养过程中缺乏力学载荷的刺激。近几十年来,我国在航空航天领域取得了巨大的成就,空间探索、科研活动、飞行训练活动日益频繁,重力场(微重力、超重)的改变对骨组织代谢影响的研究也越来越受到关注。由于细胞质和细胞内的细胞器,如细胞核、线粒体、细胞骨架(包括肌动蛋白纤维、中间丝和微管)等均有不同的密度,重力的改变可引起它们相对位置的改变。研究表明,重力场的变化对细胞的结构和功能均产生各种影响。一般来说,微重力的暴露可抑制骨质的生成。虽然超重可以通过体外高速离心的方式实现,但目前为止,关于高重力(高G)环境对骨组织细胞影响的相关研究却相当有限。最新的研究表明,超重可触发复杂的力学传导途径,在转录水平和转录后水平发生重要的调节作用。然而,超重对成骨细胞影响的确切力学生物学机制还有待深入研究。本文主要采用力学生物学方法探讨高重力(超重)的极端力学环境下成骨细胞如何响应,分子水平如何变化,成骨细胞损伤、重建的过程和机理如何,为极端力学环境下骨组织细胞的生长、分化、重建和适应性变化的研究提供理论基础。该研究是对生理载荷环境下骨组织/细胞的生长、分化、重建和适应性变化研究工作的延伸,从而发展生物力学和力学生物学的新理论、新方法和新技术,拓展生物力学研究的新领域。研究方法:1高加速度离心式加载装置构建小鼠MC3T3-E1细胞高重力模型,加速度分别为1 g、5 g、10 g、20 g、40 g,1天1次,每次30 min,共3天;2小鼠MC3T3-E1细胞经高重力暴露后,应用HE染色、透射电镜及鬼笔环肽染色分别观察MC3T3-E1细胞形态、超微结构及细胞微丝骨架的变化;3小鼠MC3T3-E1细胞经高重力暴露后,应用Edu细胞增殖实验、Annexin V-FITC/PI流式细胞术分别检测高重力对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响;qPCR及western blot检测高重力对小鼠MC3T3-E1细胞成骨相关基因及蛋白的表达及活性的影响;4采用小鼠lncRNA表达谱及mRNA表达谱芯片筛选差异表达基因及共同差异LncRNA及mRNA表达基因,构建高重力环境下影响成骨细胞基因表达调控图,筛选最相关的信号通路和信号分子,进一步研究候选基因的功能及其调控机制;5运用串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)标记的蛋白组学定量技术、联合高效液相色谱串联质谱(High performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析,研究高重力加载前后MC3T3-E1细胞蛋白质表达谱的变化,筛选差异表达的蛋白,力学生物学及分子生物学方法进一步研究重点蛋白质的功能;多组学联合关联分析转录、翻译、表达等多方面信息,深入探讨高重力在骨重建中的作用及其作用机制。结果:1小鼠MC3T3-E1细胞在正常1 g环境下,培养早期,细胞以梭形为主,细胞突起明显,细胞与细胞之间通过突起相连接,主要呈现成纤维细胞类型;培育晚期,细胞以立方形为主,细胞与细胞之间连接成片,排列成铺路石状,主要呈现上皮细胞类型。小鼠MC3T3-E1细胞在高重力环境下,随着重力加速度的不断增加(5 g、10 g、20 g、40 g)以及培养时间的逐渐增长(24 h、48 h、72 h),小鼠MC3T3-E1细胞轮廓逐渐变圆;细胞内部微丝肌动蛋白纤维增粗,细胞体积增大,轮廓变圆,与光镜下结果一致;细胞膜、细胞质、细胞核及其线粒体、内质网、核糖体等细胞超微结构均发生改变。2高重力的极端力学环境下,小鼠MC3T3-E1细胞的生物学功能发生改变。低水平(5 g)的高重力暴露,小鼠MC3T3-E1细胞增殖活性开始升高;中水平(10g和20 g)的高重力暴露,成骨细胞增殖活性显著升高;高水平的(40 g)高重力暴露,成骨细胞的增殖活性则受到抑制。低水平(5 g)的高重力刺激对成骨细胞凋亡无明显作用;中水平(10 g和20 g)的高重力刺激可引起成骨细胞轻度凋亡;高水平(40 g)的高重力刺激,对成骨细胞造成损害,引起成骨细胞的大量凋亡。低、中水平(5 g、10 g和20 g)的高重力刺激均能促进小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表达,其中,当重力加速度为10 g和20 g时,促分化作用最为明显。高水平(40 g)的高重力刺激下,小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表达下降。3芯片共检测了58,809小鼠lncRNAs和39,027小鼠mRNAs,超重环境下,大量的lncRNA和mRNA均发生改变,且随着重力加速度的增加,差异表达的lncRNA和mRNA也越来越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差异表达的lncRNAs有193个,mRNAs有35个,其中上调的有28个lncRNAs和6个mRNAs,下调的有165个lncRNAs和29个mRNAs。通过生物信息学分析了潜在的调控机制并进一步预测了差异表达的lncRNAs和mRNAs之间的相互作用关系,通过mRNAs-lncRNAs共表达网络分析鉴定了超重环境中参与骨重建的核心调控因子。结合表达谱芯片检测以及生物信息学分析结果,将lncRNA NONMMUT012703确定为高重力敏感、骨重建相关的lncRNA目标分子进行功能学研究。4通过TMT相对定量的蛋白质组学研究,发现超重环境下,大量蛋白发生变化。随着重力加速度的增加,差异表达的蛋白也越来越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差异表达的蛋白有24个,其中上调的有22个,下调的有2个。通过生物信息学分析了潜在的调控机制并预测了差异表达蛋白之间的互作关系,进一步研究重点蛋白质的功能。5针对非编码RNA(lncRNAs)表达谱、编码RNA(mRNAs)表达谱和蛋白表达谱,多组学联合关联分析转录、翻译、表达等多方面信息,深入探讨高重力在骨重建中的作用及其机制。生物信息学及后续的相关研究结果预测,NONMMUT012703作为高重力敏感、骨重建相关的候选lncRNA,可能与靶基因(如CFTR,NFATC2,SYCN,SOCS3,GIP,SNHG7OS和VMN2R90)相互作用,或与转录因子(c-Rel、HNF-3beta、E47、HLF、RFX1和COMP1)结合,通过多条信号通路(如MAPK、Jak-STAT、cGMP-PKG、Wnt、PI3K-Ak和VEGF信号通路等)之间的串话作用,共同参与超重环境下的骨重建过程。结论:1课题组自主研发的高加速度离心式加载装置可良好的模拟超重环境,适用于超重环境下细胞力学生物学效应的研究。2小鼠MC3T3-E1细胞具有成骨细胞的生物学特性,力学刺激下具有良好的生物学响应,是研究力学作用下成骨细胞生物学效应的良好模型。3成骨细胞在高重力环境下,为对抗力学刺激,细胞形态、微丝骨架及超微结构均发生改变。4高重力的极端力学环境对成骨细胞的生物学功能产生很大的影响。超重对成骨细胞增殖、凋亡和分化的影响取决于重力加速度的大小。重力加速度20 g以下为细胞安全加载范围,不会引起成骨细胞的大量凋亡。中水平(10 g和20 g)的高G刺激,小鼠成骨细胞生物学行为变化最为显著。5高重力的极端力学环境下,小鼠MC3T3-E1细胞的非编码RNA(lncRNAs)谱、编码RNA(mRNAs)谱及蛋白的表达谱均发生改变,且随着重力加速度的增加,差异变化的基因和蛋白也逐渐增多。6重力场变化情况下获得的在成骨分化过程中具有差异表达的lncRNA可能是骨组织损伤、修复与重建过程中的潜在靶标。7成骨细胞受到超重暴露后差异表达的蛋白可能是重力敏感、骨重建相关的生物标志蛋白。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R85
【图文】：

可读框,转录本,长链,力学

图 1-1 骨的结构与力学适应性长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过 200个核苷酸（nt）的 RNA，不具有长可读框且无编码蛋白功能。在不同的组织之间lncRNA 表达量不同，且同一组织在不同生长阶段 lncRNA 表达量也存在差异[24]。lncRNA 与 mRNA 作为转录本，有很多相似之处，他们均在 RNA 聚合酶Ⅱ的作用下进行转录，转录后可进行剪切，并且 3′端有 poly(A)尾巴的结构。与 mRNA 相比，lncRNA 在不同物种间保守性更差，表达水平也更低。从发现之初，不具有生物学功能的“转录噪音”到现在的“明星分子”，大量的研究表明，lncRNA 在正常细胞功能维持和疾病发生发展过程中都具有重要作用。例如：有研究显示定位于失活 X 染色体的 lncRNAXist 包被将要失活的 X 染色体，并招募多梳抑制复合体 2 移行至 X 染色体失活中心，在 X 染色体失活过程中发挥了重要作用[26]，这一研究提供了第 1 个直接的证据，揭示了与蛋白质调控方式不同，lncRNAs 可以利用它们的基因组信息（包括环境和位置）来发挥作用，将靶标集合到一起；还有lncRNA-LALR1 能够招募 CTCF 至 Axin1 启动子区域从而抑制 Axin1 的表达，进而激活 Wnt/β-Catenin 信号通路，促进 Cyclin D1 表达，从而促进肝癌细胞增殖[27]；

细胞功能,病理过程,调控机制,基础研究

图 1-2 lncRNA 调控机制在骨组织工程、临床与基础研究领域，已经发现一些 lncRNA 可通过影响多种因子的表达，调控骨组织细胞功能，参与骨相关疾病的病理过程。新近的研究表明，成骨形成过程中 H19 表达显著上调[30]。另一研究显示，lncRNA DANCR 可招募多梳抑制复合体 EZH2，通过调控后者与成骨调节基因 Runx2 启动子的结合，抑制成骨形成[31]。敲除人牙周膜干细胞的 DANCR 基因，可激活细胞β-catenin/Wnt信号传导通路，并促进成骨细胞形成[32]。组蛋白去乙酰化酶（SIRT1）作为一个重要的正向调节骨量和成骨形成的因子，其对 lncRNA HIF1A-AS1 发挥调控成骨功能至关重要。研究显示，过表达 SIRT1 后，HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表达显著减少，而基因敲除或药理学阻断 SIRT1 后 HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表达显著增加[33]。诱导多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中，MEG3 高表达。正常成骨细胞靶向敲除 MEG3 后，BMP4 的表达显著降低，成骨细胞分化功能受到抑制。外源性加入 BMP4 或异位 MEG3 过表达可用以治疗多发性骨髓瘤患者的MSCs 成骨缺损[34]。微阵列分析人骨髓 MSC 与体外诱导培养 2 周的软骨细胞lncRNA 时，发现 3000 多 lncRNA 表达具有显著差异，其中 3 个 lncRNA

液相色谱,骨重建,串联质谱,力学环境

军事科学院博士学位论文用。该技术运用 10 种同位素的标签，将多肽的氨基基团进行标记，通过HPLC-MS/MS 分析技术，同时比较 10 组不同样品中蛋白质的相对含量。相对于其他蛋白定量技术，其检测灵敏度高，低丰度蛋白也可被检测；检测范围广，几乎任何物种的各类蛋白质均可被分离鉴定；检测通量高，10 组不同样本中蛋白质的相对含量可被同时鉴定分析；检测效能高，通过氨基标记反应，标记率高，液相色谱与串联质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好，目前该技术已在很多对比分析实验中得到了验证。蛋白质组学技术作为一种高通量、高灵敏度的方法与基因芯片一并成为后基因组时代生命科学研究的重要技术，是“功能蛋白质组学”和“功能基因组学”的有力研究手段。采用这两种实验技术构建lncRNA-mRNA 和靶蛋白的网络关系，将特异 lncRNA、蛋白机制作用研究与网络研究相结合，极有可能找到高 G 环境下骨重建的有效力学作用靶点。

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