气泡诱导的内皮微粒在减压病血管炎性损伤中的作用及其形成机制

发布时间：2020-08-21 07:24

【摘要】：减压病(decompression sickness,DCS)是威胁潜水等高气压作业和航空航天等活动安全的关键医学问题,快速减压过程和减压后惰性气体过饱和生成的气泡是引起DCS发病的根本原因。传统观点认为,气泡的机械作用,如栓塞作用、剪切力作用、机械压迫作用是导致DCS形成的根本原因。随着研究的深入,越来越多的证据表明气泡作为外源性物质可触发体内一系列生化及炎症反应,如血小板聚集、白细胞激活、细胞因子释放等,诱发血管内凝血及炎症反应,导致血栓形成,组织缺血水肿,炎细胞渗出,这可能在DCS的发生和发展中发挥更为重要的作用。微粒(microparticles,MPs)是细胞在激活或凋亡早期以出芽方式分泌的直径约0.1~1μm不规则囊性小泡。MPs表面可携带母细胞表面抗原,其内容物含有浓集细胞因子、信号蛋白、mRNA和microRNA。作为细胞间生物信号和信息传递的载体,MPs可将其胞内成分转移至靶细胞,介导靶细胞活化、表型修饰、及功能调节。内皮细胞来源的MPs,即内皮微粒(endothelial microparticles,EMPs)不仅是内皮损伤的重要指标,在介导内皮功能障碍中同样发挥显著的致病作用。EMPs在血管炎症、血管舒缩功能、血管生成等方面发挥多重作用。诸多生理及病理因素均可激活或损伤内皮细胞,导致EMPs的产生与释放。Madden等研究发现,潜水员完成潜水作业返回水面后,循环中EMPs数量显著增加,提示血管内皮功能损伤。Thom等通过一系列人体试验发现,潜水员经不同方案潜水后,循环MPs数量和多普勒超声检测的血管内气泡信号强度呈正相关;小鼠经模拟潜水后快速减压,循环血液中各亚型MPs的数量均显著增加,并通过激活血小板和中性粒细胞增加血管内白细胞粘附,进一步加重DCS血管炎性损伤,甚至可导致DCS中枢神经系统损伤。如提前给予MPs消融剂聚乙二醇,则可显著降低DCS所致血管炎性损伤。上述研究结果表明MPs可能在DCS血管炎性损伤中发挥重要的致病作用。本课题组前期研究发现,大鼠模拟潜水后快速减压,循环内EMPs显著增加,同时伴有脑、骨骼肌和大网膜中中性粒细胞显著滞留现象,提示广泛的血管炎症反应;如在潜水前给予内皮保护剂辛伐他汀后,可显著降低DCS发病率,减轻肺组织炎性损伤,同时循环内EMPs数量增幅显著下降,各组织器官中性粒细胞滞留程度显著下降。因此,我们推测在DCS的发病过程中,气泡通过直接触碰或改变血液层流剪切力,导致血管内皮细胞被激活或损伤,产生和释放EMPs并进一步诱发血管炎症损伤级联放大效应。为观察DCS气泡诱导的EMPs在血管炎性损伤中的确切效应,我们通过自制的微气泡生成装置模拟DCS气泡对内皮细胞的刺激作用,检测气泡刺激后培养液中EMPs生成数量的情况,判断血管内皮损伤的程度;在细胞及动物水平分别观察气泡刺激诱导的EMPs对血管内皮的损伤效应(第一部分)。在明确气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放并进一步对内皮细胞产生损伤效应后,本课题组进一步探索气泡诱导EMPs产生的分子机制,寻找其中的关键信号分子,从而为DCS的防治寻找新方法与新思路(第二部分)。此外,针对DCS致病的根本原因——气泡,寻找促进气体交换、减少气泡生成的方法,为DCS的防治寻找新的的非加压治疗手段。第一部分:气泡诱导的内皮微粒对内皮细胞的作用研究研究方法:本研究以原代培养的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)为研究对象,通过自制的气泡发生装置,将气泡与PMVECs接触30 min后,继续培养6 h,后收集培养液。4~oC,10000 g×30 min离心,去除细胞碎片,收集上清;4 ~oC,100000 g×60min离心,弃去上清。1×PBS重悬,流式细胞法检测EMPs的数量。在明确气泡刺激诱导EMPs产生与分泌的效应后,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育或经尾静脉注射入大鼠体内,在体与离体条件下分别观察内皮损伤相关指标的变化情况。此外,将EMPs与含氟表面活性剂FSN-100共孵育,观察FSN-100对EMPs的消融作用。研究结果:本课题组成功分离与培养出纯度大于95%的大鼠PMVECs并用于后续实验。流式结果显示气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育后,内皮细胞活性显著下降(存活率下降,凋亡率上升)。内皮细胞产生与分泌细胞间粘附分子(ICAM-1)和血管内皮粘附分子(VCAM-1)显著增加,内皮细胞内活性氧(ROS)产生增加、一氧化氮合成(NO)减少,细胞间紧密连接下降,内皮通透性增加。在体实验中,大鼠循环内皮损伤指标可溶性血栓调节蛋白(s-TM)及粘附分子ICAM-1和VCAM-1含量显著增高,提示内皮广泛而严重的损伤。FSN-100可显著减轻气泡诱导的EMPs对内皮的不良效应。结论:气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放且气泡诱导的EMPs可进一步促进血管功能障碍及炎性损伤。第二部分:气泡诱导内皮微粒产生的机制研究研究方法:本研究以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,气泡诱导EMPs产生的方法同“第一部分”。应用荧光探针或流式细胞术的方法检测气泡刺激后胞内Ca~(2+)浓度的变化并利用Ca~(2+)通道阻滞剂LaCl_3(100μM)观察胞内Ca~(2+)对气泡诱导EMPs产生的影响。此外,流式法检测气泡刺激后胞膜翻转酶Flippase活性的变化及磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外露的情况,并进一步分析Ca~(2+)是否在其中发挥作用;利用荧光显微镜观察骨架蛋白F-actin在胞膜共定位情况并进一步分析Ca~(2+)是否在其中发挥调控作用。Western blot法分别检测诱导骨架蛋白重构的重要信号分子——细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2),肌球蛋白轻链(MLC)激活情况并进一步利用相应的分子抑制剂明确其在诱导EMPs释放中的确切作用。研究结果:内皮细胞经气泡刺激后,内皮细胞内Ca~(2+)浓度显著增高,且气泡诱导EMPs的数量与胞内Ca~(2+)浓度具有明显的正相关性(r=0.687,P0.05)。气泡刺激内皮细胞后,p-ERK1/2,p-MLC水平明显上升(P0.05,P0.05),细胞膜骨架蛋白共定位显著减少、骨架蛋白重构增加(P0.05)。应用ROCK抑制剂Y27632后,p-MLC水平被显著抑制,骨架蛋白重构减少,同时气泡诱导EMPs释放的数量显著降低(P0.05)。气泡刺激后,内皮细胞翻转酶Flippase活性明显下降,胞膜PS外露显著增加。应用Ca~(2+)通道阻滞剂后可显著减轻上述效应中除ERK1/2被激活之外的所有作用。结论:气泡刺激血管内皮后通过触发胞内Ca~(2+)增加激活Rho/ROCK通路并引起细胞膜骨架蛋白共定位减少、骨架蛋白重构,同时抑制翻转酶Flippase活性导致PS外露增加,促进EMPs的产生与释放。第三部分:肺表面活性物质对大鼠减压病的保护作用研究研究方法:实验前12 h给予大鼠雾化吸入10 mg肺表面活性物质(Surfactant)或生理盐水(Saline),然后建立DCS模型(空气模拟潜水:60 m水深,90 min高压暴露,3 min匀速减至常压)。观察大鼠DCS发病并探测血管内气泡生成情况,检测大鼠内皮炎症及氧化损伤相关指标。研究结果:雾化吸入Surfactant可显著降低大鼠DCS发病率及死亡率(75.0%vs.46.4%,P0.01;28.6%vs.14.3%,P0.01),DCS发病潜伏期和生存期明显延长(P0.05)。血管内气泡生成量显著下降(P0.01)。大鼠全身性炎症及肺内炎症指标(白介素1β和白介素6)较Saline组明显降低(P0.01),内皮损伤相关指标(肺W/D,肺泡灌洗液蛋白,E-选择素,ICAM-1,EMPs)较Saline组明显降低(P0.05),氧化与抗氧化(GSH/GSSG)失衡显著改善(P0.01)。结论:雾化吸入Surfactant可通过抑制肺内炎症反应、改善肺功能、促进惰性气体排出明显减少血管内气泡生成;辅以抗氧化及保护内皮作用预防大鼠DCS的发生。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R845.21
【图文】：

气泡,内皮细胞,苯基吲哚,减压病

气泡诱导的内皮微粒在减压病血管炎性损伤中的）。内皮细胞用其特异性标记物 VIII 因子相关抗原（ 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色视野，并在每个视野中计数 100 个细胞，计算 VII结果表明 PMVECs 纯度达 95%以上，为后续实验功构建了气泡刺激内皮细胞体外模型。如图 1-1B 所置相结合的方法，达到模拟 DCS 发生后气泡触碰血

气泡,消融效果,内皮细胞,含氟表面活性剂

1-2 气泡刺激诱导 EMPs 产生与释放及 EMPs 消融著促进内皮细胞产生与分泌 EMPs；FSN-100 可有效效果越好。n=3，*P<0.01。泡诱导的 EMPs 对内皮活性的影响的EMPs与正常内皮共培养12 h后，细胞存活率下降Ps，P<0.05）；此外，细胞凋亡率显著增加（图 1-3B EMPs 与含氟表面活性剂 FSN-100 共孵育能够有效

气泡,对正,含氟表面活性剂,细胞存活率

（三）气泡诱导的 EMPs 对内皮活性的影响将气泡诱导的EMPs与正常内皮共培养12 h后，细胞存活率下降至86%（图1-3A，正常对照 vs. EMPs，P<0.05）；此外，细胞凋亡率显著增加（图 1-3B，2.4% vs. 7.2%，P<0.05）。提前将 EMPs 与含氟表面活性剂 FSN-100 共孵育能够有效地逆转气泡诱导

【相似文献】