体液特异性DNA甲基化标记的独立验证和分析
发布时间：2020-09-08 14:52
研究背景刑事侦查中,判定案发现场收集的可疑生物斑的组织来源,为犯罪现场重建、案件事实查明提供重要线索。近年来基于mRNA/microRNA的分子生物学方法被广泛探索,研究证实其特异性、灵敏度较传统鉴定方法高,但稳定性容易受空气中存在的核糖核酸酶影响,因此难以广泛应用于法医学实践。基于DNA甲基化标记的方法具有特异性好、灵敏度和稳定性高、不额外消耗生物检材、和法医标准试验室DNA分型平台相兼容等优势,成为法医学界新的研究热点。人类基因组中存在大量组织特异性差异甲基化区域(tDMRs),通过比对这些区域的甲基化状态可以鉴定不同的组织类型。近年来法医学相关研究报道了一些体液特异性DNA甲基化标记,可有效鉴定生物斑的组织来源,但依然存在诸多问题,如不同研究筛选出的甲基化标记不一致以及不同体液间甲基化水平容易出现交叉。因此有必要对现有研究结果通过统一平台作验证比较分析,通过采用准确可行的甲基化定量方法,筛选出适用于本地人群的更加高效的体液来源鉴定标记,为建立可靠的体液来源鉴定方法提供一定的参考。方法从相关文献报道中选择五种体液特异性较好的CpG位点作为本次研究的候选标记。以人体外周血、精液、唾液、阴道分泌液和月经血五种常见法医学体液斑为研究样本,每种体液斑20例。采用甲基化SNaPshot方法,经基因组DNA提取,亚硫酸盐转化,PCR扩增,单碱基引物延伸,毛细管电泳分析等步骤,检测候选CpG位点的甲基化水平。最后对每个候选CpG位点在不同体液的甲基化特异性和个体稳定性进行分析,筛选出甲基化体液特异性强且稳定性好的CpG位点。CpG位点甲基化水平计算公式为:甲基化%=C峰高/(C峰高+T峰高)×100=G峰高/(G峰高+A峰高)×100。结果本课题筛选出了9个较为理想的体液特异性DNA甲基化标记:精液特异性低甲基化标记cg22407458-288d,精液特异性高甲基化标记cg05656364-283d;血液特异性高甲基化标记cg08792630,血液特异性未甲基化标记cg26285698+39d和cg26285698-14d;唾液特异性高甲基化标记cg09652652-2d;阴道分泌液特异性高甲基化标记cg26079753-7d;月经血特异性甲基化标记cg09696411和cg09696411+25d。结论本次研究利用复合甲基化SNaPshot的方法验证筛选出9个在本地人群具有更高体液特异性和个体稳定性的DNA甲基化遗传标记,为构建更加高效、可靠的体液来源鉴定方法提供可靠的参考。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：D919
【部分图文】：
图 2 五种体液 M1 体系甲基化检测电泳图2.2.2 M2 体系甲基化检测电泳图结果血液鉴定候选标记 BL1 显示出较高的血液特异性，在血液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他体液低甲基化（月经血，甲基化水平 0.6）甚至完全未甲基化（精液、唾液和阴道分泌液）。唾液鉴定候选标记 SA1 显示出极高的唾液特异性，在唾液中高甲基化（甲基化水平 0.85），其他体液完全未甲基化。
图 3 五种体液 M2 体系甲基化检测电泳图2.2.3 M3 体系甲基化检测图结果精液鉴定候选标记 SE4 和 SE3 显示极高的精液特异性：SE4 在精液中完全甲基化，在其他体液完全未甲基化；SE3 在精液中完全未甲基化，在其他体液完全甲基化。血液鉴定候选标记 BL3 显示较高的血液特异性，在血液中完全未甲基化，在其他体液中部分甲基化。血液鉴定候选标记 BL5 未显示血液特异性，几乎在所有体液中均未甲基化。唾液鉴定候选标记 SA3 显示精液特异性高甲基化，在精液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他体液低甲基化（血液、唾液、月经血，甲基化水平 0.3），甚至未甲基化（阴道分泌液）。阴道分泌液鉴定候选标记 VF4显示出阴道分泌液特异性，虽然在阴道分泌液甲基化水平很低（约 0.1），但在其他体液完全未甲基化。
图 4 五种体液 M3 体系甲基化检测电泳图2.2.4 M4 体系甲基化检测电泳图结果血液鉴定候选标记 BL6 并未显示血液特异性，在血液、阴道分泌液和月经中均显示较低甲基化（甲基化水平约 0.2），在精液和唾液中完全未甲基化；血鉴定候选标记 BL4 显示出较好的血液特异性，在血液中完全未甲基化，在其他液显示部分甲基化（阴道分泌液、月经血），甚至完全甲基化（精液、唾液）阴道分泌液鉴定候选标记 VF3 显示精液特异性未甲基化，在其他体液中低甲基（甲基化水平 0.2）。唾液鉴定候选标记 SA2 显示较高的唾液特异性，在唾液高甲基化（甲基化水平 0.7），其他体液完全未甲基化。月经血鉴定候选标记 和 MB2 显示极高的月经血特异性，在月经血中高甲基化（甲基化水平约 0.25）其他体液完全未甲基化。
本文编号：2814307
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：D919
【部分图文】：
图 2 五种体液 M1 体系甲基化检测电泳图2.2.2 M2 体系甲基化检测电泳图结果血液鉴定候选标记 BL1 显示出较高的血液特异性，在血液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他体液低甲基化（月经血，甲基化水平 0.6）甚至完全未甲基化（精液、唾液和阴道分泌液）。唾液鉴定候选标记 SA1 显示出极高的唾液特异性，在唾液中高甲基化（甲基化水平 0.85），其他体液完全未甲基化。
图 3 五种体液 M2 体系甲基化检测电泳图2.2.3 M3 体系甲基化检测图结果精液鉴定候选标记 SE4 和 SE3 显示极高的精液特异性：SE4 在精液中完全甲基化，在其他体液完全未甲基化；SE3 在精液中完全未甲基化，在其他体液完全甲基化。血液鉴定候选标记 BL3 显示较高的血液特异性，在血液中完全未甲基化，在其他体液中部分甲基化。血液鉴定候选标记 BL5 未显示血液特异性，几乎在所有体液中均未甲基化。唾液鉴定候选标记 SA3 显示精液特异性高甲基化，在精液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他体液低甲基化（血液、唾液、月经血，甲基化水平 0.3），甚至未甲基化（阴道分泌液）。阴道分泌液鉴定候选标记 VF4显示出阴道分泌液特异性，虽然在阴道分泌液甲基化水平很低（约 0.1），但在其他体液完全未甲基化。
图 4 五种体液 M3 体系甲基化检测电泳图2.2.4 M4 体系甲基化检测电泳图结果血液鉴定候选标记 BL6 并未显示血液特异性，在血液、阴道分泌液和月经中均显示较低甲基化（甲基化水平约 0.2），在精液和唾液中完全未甲基化；血鉴定候选标记 BL4 显示出较好的血液特异性，在血液中完全未甲基化，在其他液显示部分甲基化（阴道分泌液、月经血），甚至完全甲基化（精液、唾液）阴道分泌液鉴定候选标记 VF3 显示精液特异性未甲基化，在其他体液中低甲基（甲基化水平 0.2）。唾液鉴定候选标记 SA2 显示较高的唾液特异性，在唾液高甲基化（甲基化水平 0.7），其他体液完全未甲基化。月经血鉴定候选标记 和 MB2 显示极高的月经血特异性，在月经血中高甲基化（甲基化水平约 0.25）其他体液完全未甲基化。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 李永增;谢树森;陈荣;;人体组织拉曼光谱检测与技术进展[J];中国激光医学杂志;2011年03期
本文编号：2814307
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