华东汉族高信息量Y-SNP位点的筛选及分型方法的建立

发布时间：2020-09-17 12:30

　　实验目的:筛选出在中国华东汉族人群中具有高度信息量的Y-SNP位点,联合运用多重PCR技术和质谱技术、微测序技术,建立Y-SNP分型方法,为特殊的亲缘关系鉴定提供分型平台,同时探讨微测序方法对男女混合DNA样本检测的适用性,并累积我国的Y-SNP群体遗传学资料。实验材料:在知情同意的原则下,收集华东汉族无关男性个体血样343份,Y-STR有突变的同一父系血样23对,4℃保存备用。检测时取男性DNA标准品9948、2800M作为阳性对照,实验中的混合样本由男性DNA标准品9948和女性DNA标准品9947A混合制成。实验方法:根据Y染色体系统树及生物信息数据库(NCBI)中的Y-SNP信息,选择在东亚人群中具有多态性的Y-SNP位点71个用于多重PCR技术和质谱技术的分型,从中筛选出在华东男性群体具有中高度信息量的位点近30个,建立多重PCR技术和SNaPshot分型技术,应用于同父系个体(生物学父子、兄弟、叔侄、爷孙等)的Y-SNP分型,分析其遗传稳定性;另外,为了评估该法用于强奸案检验的可能性,对男女混合DNA样本(按1∶1、1∶4、1∶9、1∶19的比例混合)进行了Y-SNP分型,考察男性成分的分型结果能否不受女性物质的干扰。实验结果:得到71个Y-SNP位点的群体遗传学数据。经统计学分析,其中18个位点在华东汉族男性群体具有高度信息量(GD≥0.3),32个位点具有中度信息量(0.2≤GD0.3)。为了使该技术手段能推广应用于各个法医物证学实验室,最终选定29个Y-SNP位点,建立了多重PCR技术和基于微测序原理的SNaPshot分型技术。这29个位点(rs9785908、rs9786247、rs2267801、rs17269816、rs17276358、rs9786707、rs2032678、rs11096432、rs2032674、rs13447354、rs17276345、rs17842387、rs16980363、rs17269928、rs2032665、rs9306848、rs4589047、rs16980610、rs16980641、rs2075640、rs9306845、rs9786502、rs16980601、rs17174528、rs16980426、rs17316592、rs11096433、rs52812045、rs2075181)均具有较高的多态性(GD≥0.2),共检测到64种单倍型.对于日常检见的Y-STR突变案例(父子、兄弟、叔侄、爷孙等),运用所建立的29个Y-SNP位点的多重PCR扩增和SNaPshot分析技术进行检测,分型结果均吻合,证明了SNP位点遗传的稳定性。关于男女混合样本,在四种混合比例下(1∶1、1∶4、1∶9、1∶19),均能得出男性样本的分型,且结果清晰、可靠。结论:本课题从Y染色体上筛选出了适合华东汉族人群亲权鉴定和个体识别的多态性Y-SNP位点,并建立了质谱分型方法,最终选定29个位点所建立的微测序法适用于法医物证学办案实际,在某些疑难案件的鉴定中可以发挥重要作用。同时,本课题所建立的技术方法还有助于我国DNA数据库的完善和人类学研究,并能运用于人口迁移进化、人口历史和家系变化等多个研究领域。
【学位单位】：华东政法大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：D919
【部分图文】：

技术原理

在最终选定 29 个中高度信息量 Y-SNP 位点之后，选用 SNaPshot 技术平试剂盒和遗传分析仪见图1、图2）进行分型检测。SNaPshot 是种荧光标记单碱基延伸反应，延伸反应的体系内加入 ddNTP 双脱三磷酸，延伸产物的长度仅比延伸引物长度多 1 个 bp，这 1 个 bp 所代表的碱基就变位点的基因型。原理显示于图 3。该方法可以同时建立多个 SNP 位点的分析体系，且技术成熟，数据处理简单快实验中可实现自动化操作，有利于减少人为影响，在分析大量样本时具有优势。图 1 SNaPshot Multiplex Kit图 2 3130XL 遗传分析仪

遗传分析

为了筛选出适用于我国华东汉族男性人群个体识别和亲权鉴定的中高度信息-SNP 位点，本着知情同意的原则，收集了华东汉族 343 名无关男性样本的血样（其05 名个体的血样用于质谱平台，138 名个体的血样用于 SNaPshot 平台）。另外，为索其实际应用价值，从检案中挑选出了经Y-STR检测有突变的父系亲缘关系样本23（三）本课题所使用的检测方法和平台首先采用 Agena 公司研发的 MALDI-TOF MS 检测平台从华东汉族男性群体筛选多态-SNP 位点，在最终选定 29 个中高度信息量 Y-SNP 位点之后，选用 SNaPshot 技术平台（试剂盒和遗传分析仪见图1、图2）进行分型检测。

光谱图,光谱,遗传分析,甲酰胺

取新 96 孔板，每孔中加入 0.5μL 单碱基延伸纯化产物，甲酰胺和 GeneS120 LIZ 按 9∶0.5 的比例混匀配置成 1.5mL 溶液，加在 96 孔板中，每9.5μL，3000r/min 离心 5s，放置于 9700 扩增仪进行变性，参数设置为：95℃ 54℃ 5min，然后用 3130XL 遗传分析仪进行分型检测。实验前进行光谱校正：首先，将甲酰胺（Hi-Di Formamide+）和 DS-02 MatStandard 按照 19∶1 的比例混匀，放置于 3130XL 遗传分析仪中。打开电脑中Data Collection Software v3.0 软件，选择“Protocol Manager”，在下拉中点击“新建”，随后在出现的对话框中依次设置相应选项，将“Dye Set”为 E5，“Polymer”设为 POP4，“Array Length”为 36，“chemistry”设为 MatStandard，“Run Module”命名为“SNaPshot DS-02”。随后点击“Edit Paramete并输入相关参数。随后设置“Run module”，同样打开软件，选择“Module Manage在下拉栏中选择“新建”，在新对话框中输入相关设置和名称，点击“ok”保存随后点击左上角运行进行光谱校正。校正结果见图 4。

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