RIP3在甲基苯丙胺诱导多巴胺能神经元程序性坏死的作用机制

发布时间：2020-10-01 17:46

　　研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH俗称“冰毒”,是一种新型合成毒品。因其见效快、兴奋持续时间长、价格低以及合成技术简单等特点,已成为全球滥用排名第二的毒品。METH滥用对多器官具有毒性损伤作用,其中对中枢神经系统的毒性损伤作用尤为突出。大量的临床资料表明,METH可对大脑神经元产生直接的损害作用,导致神经元变性、坏死,并出现一系列急慢性功能障碍。一直以来,关于METH神经毒性损伤的研究往往与其导致神经细胞凋亡及自噬相关,但对METH诱导的神经元程序性坏死则未见报道。研究表明程序性坏死(Necroptosis)与多种疾病的发生发展有关,包括创伤、缺血/再灌注损伤、神经退行性变等。因此我们对METH是否可以导致神经元发生程序性坏死及其机制进行了探索,发现METH可以引起程序性坏死关键信号分子受体相关作用蛋白激酶-3(Receptor-interacting protein kinase 3,RIP3)表达升高及活化,但RIP3 是怎样介导METH诱导的神经元程序性坏死呢?目的:本课题拟探讨RIP3在METH诱导的多巴胺能神经元程序性坏死的分子机制,旨在明确了 RIP3在METH介导的细胞程序性坏死中的作用,完善和补充METH介导的细胞死亡的机制,为METH神经毒性损伤机制研究及基因干预提供理论依据。方法:本课题拟从吸食METH死者的脑组织标本入手,通过形态学观察确定METH能引起神经元发生坏死。通过构建体内、外METH染毒模型,使用特异性抑制剂,慢病毒干扰干预RIP3的表达及活化。采用HE染色,免疫组化染色,Western Blot,TUNEL染色,免疫荧光等技术检测干预前后RIP3的表达情况,及其下游信号通路分子的变化情况探讨RIP3在METH诱导的神经元程序性坏死作用。结果:1.吸食METH死者纹状体区域出现噬神经现象,表明了 METH可以促进神经元发生坏死,同时检测到RIP3蛋白的表达升高。2.METH染毒小鼠模型纹状体区域中也发现了类似现象,同时高表达RIP3蛋白的区域,神经元死亡数量也明显升高,表明了RIP3在METH诱导的细胞程序性坏死中起了关键作用。3.敲低RIP3表达后,纹状体区域神经元死亡数量得到了恢复,而且pMLKL(S345)和pDRP1(S616)蛋白表达以及外周血血浆中NSE含量,线粒体分裂均降低,RIP3可能通过激活下游蛋白MLKL和DRP1来介导细胞发生程序性坏死。4.METH可引起原代多巴胺能神经元中RIP与RIP3相互作用并激活RIP3同时激活下游的MLKL蛋白,从而破坏细胞膜引起细胞程序性坏死。5.激活的DRP1会移位到线粒体中,引起线粒体分裂增多,线粒体膜电位下降,ROS产生增多等紊乱现象从而介导细胞发生程序性坏死。结论:RIP3在METH诱导的多巴胺能神经元程序性坏死起了关键性作用,为METH的神经毒性治疗提供可能的分子干预靶点。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：D919
【部分图文】：

均匀分布,小鼠模型,胶质细胞

领士学位论文逡逑２结果逡逑２．１人体标本和ＭＥＴＨ染毒小鼠模型纹状体组织形态学改变逡逑在正常状态下，胶质细胞在均匀分布在纹状体中，当暴露在ＭＥＴＨ后，ＨＥ逡逑结果显示胶质细胞在神经元周围强烈聚集，而免疫组织化学法检测可发现聚集逡逑在神经元周围的胶质细胞部分为活化的小胶质细胞（噬神经细胞现象），与对照逡逑组形成明显差异。这初步证实了在人或ＭＥＴＨ染毒小鼠模型中，ＭＥＴＨ都可以逡逑导致多巴胺能神经元发生坏死。（图１－１邋Ａ、Ｂ）逡逑

区域图,人体标本,小鼠模型,纹状体

热径炯U型纹状体组织形态学以及Ｒ１Ｐ３蛋白改变逡逑模型中，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光结果均显示，给药组中ＲＩＰ３蛋白的表达明显上逡逑升，与对照组相比具有明显差异。（＊Ｐ＜0．000ｌ）。（图１－２Ｂ、Ｃ、Ｄ）逡逑Ａ逦Ｄ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＭＥＴＴ１逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＭＬｌｌｌ－Ｔｒｅａｔｅｄ逡逑－■ＭＢ逡逑；■■■邋—邋—邋—ｉ逡逑■■■邋＾邋■■逡逑图１－２邋ＭＥＴＨ处理后，人体标本或ＭＥＴＨ染毒小鼠模型纹状体区域ＲＩＰ３的表达升高。逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＩＰ３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｉｎ邋ｈｕｍａｎ邋ａｎｄ邋ｍｉｃｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ＭＥＴＨ逡逑２．３ＲＩＰ３蛋白表达升高的区域，ＴＵＮＥＬ信号也明显升高逡逑ＭＥＴＨ处理后，小鼠纹状体中ＲＩＰ３蛋白的表达己被证实明显升高，同时在逡逑此区域中可以检测到ＴＵＮＥＬ信号明显增强，这初步得出了邋ＲＩＰ３能介导ＭＥＴＨ逡逑诱导的细胞坏死。（图１－３）逡逑ＲＩＩＭ逦ＴＵＮＥＬ逦ＯＡＰＩ逡逑ｍｍｍｍ逡逑■■■■逡逑图１－３邋ＲＩＰ３蛋白表达升氋区域中，ＴＵＮＥＬ信号增强逡逑Ｆｉｇ．１－３邋ｔｈｅ邋ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＲＩＰ３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒｉａｔｕｍ邋ｗａｓ邋

变化情况图,纹状体,小鼠,变化情况

逦第二章邋ＲＩＰ３在ＭＥＴＨ诱导的神经元程序性坏死的作用逦逡逑２．３动物模型中ＭＬＫＬ、ｐＭＬＫＬ（Ｓ３４５）和ＤＲＰ１、ｐＤＲＰｌ（Ｓ６１６）蛋白的表达变逡逑化情况以及线粒体的改变逡逑（ｌ）Ｗｅｓｔｅｒａ邋ｂｌｏｔ和免疫荧光法检测纹状体细胞内ｐＭＬＫＬ（Ｓ３４５）蛋白表达情逡逑况。结果显示：与ＬＶ－ＧＦＰ组相比，ＬＶ－ＧＦＰ＋ＭＥＴＨ组细胞内ｐＭＬＫＬ（Ｓ３４５）蛋逡逑白的表达含量明显升高，而当纹状体细胞内ＲＩＰ３被敲低时，ｐＭＬＫＬ（Ｓ３４５）蛋白逡逑的表达也同时降低（＊Ｐ＜0．000１）。（图２－４Ａ、Ｂ）邋ＭＬＫＬ曾多次被报道其磷酸逡逑化状态会形成寡聚体从而破坏细胞膜完整性，介导细胞发生坏死ＲＩＰ３可能逡逑通过ＭＬＫＬ的磷酸化介导ＭＥＴＨ诱导的细胞程序性坏死。而免疫荧光结果也与逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋结果相似。（图邋２－４Ｃ）逡逑Ａ逦Ｂ逡逑２0

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