模拟失重下氧化应激处理EA.hy926细胞miRNAs测序和生物信息学分析

发布时间：2020-11-04 12:21

　　 目的失重或模拟失重条件下可引起血管内皮细胞对氧自由基(ROS)产生增加,清除能力下降,导致氧化应激反应增强从而诱导内皮细胞功能异常。内皮细胞的结构、功能完整性对失重血管功能调节、防止动脉硬化的发生至关重要,而microRNAs(miRNAs)广泛参与了内皮细胞结构功能重构的调节。本研究通过细胞回转模拟失重,探索EA.hy926细胞(HUVEC与肺癌细胞系A549的融合物)氧化应激后差异表达的miRNAs及其意义。方法1.将EA.hy926细胞接种在细胞培养瓶,将细胞分为对照组(C组)、对照氧化应激组(C+H_2O_2组)、模拟失重组(Z组)和模拟失重后氧化应激组(Z+H_2O_2组)四组。Z、Z+H_2O_2组装满细胞培养基,固定在细胞回转器上,设定30转/分37℃回转培养72小时;将C、C+H_2O_2组同样灌满培养液放于37℃恒温培养箱中同时进行培养;培养完毕后将所有细胞更换5ml/瓶新鲜培养液,用终浓度50mmol/L的过氧化氢刺激细胞C+H_2O_2、Z+H_2O_2组5小时,然后收集细胞以备后续实验;2.采用二代测序技术对C、C+H_2O_2、Z和Z+H_2O_2四组细胞进行miRNA测序,通过测序技术筛选不同组别间差异表达的miRNAs,采用相对定量法对各组别间共同差异表达的miRNAs进行RT-qPCR验证;3.对经qPCR验证差异表达与miRNA测序趋势一致的差异miRNAs展开生物信息学分析,通过生物信息学分析,了解差异表达miRNAs靶基因的显著功能富集、显著信号通路、蛋白互作关系;并对处于蛋白互作关系中的核心蛋白进行Western blot验证。结果通过显著水平P0.05及差异倍数log2FC2或-2筛选差异表达miRNAs,C+H_2O_2 vs C有102个差异表达miRNAs,其中53个基因表达上调,49个基因表达下调;Z vs C中97个差异miRNSs(17个基因表达上调,80个基因表达下调);Z+H_2O_2 vs Z中71个差异miRNSs(52个基因表达上调,19个基因表达下调);Z+H_2O_2 vs C+H_2O_2中66个差异miRNSs(38个基因表达上调,28个基因表达下调)。RT-qPCR结果显示,与C+H_2O_2组相比,Z+H_2O_2组hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表达增加,与miRNA测序结果一致。hsa-miR-29b-3p靶基因为ERCC6、NFIA、TET3、BRWD3、FBN1、TET1、ATAD2B、RNF19A等,hsa-miR-200c-3p靶基因为APOO、OSTM1、PAIP2、SULF1、KIAA1432、KDR、BAP1、DGKA、KLF4等。GO功能分析显示二者富集于生物学粘附等生物过程,细胞连接等细胞组分、细胞结合等分子功能亚层。KEGG通路显示hsa-miR-29b-3p靶基因显著富集于局部黏附等信号通路,hsa-miR-200c-3p靶基因显著富集于癌症通路等信号通路。STRING蛋白互作分析结果表明hsa-miR-29b-3p靶基因中COL家族蛋白处于互作的关键位置,hsa-miR-200c-3p靶基因中RHOA处于互做的关键位置,经Western blot验证核心蛋白RHOA,BCL-2在Z+H_2O_2 vs C中具有显著表达趋势。结论模拟失重下氧化应激可诱导EA.hy926内皮细胞包括hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-200c-3p在内的miRNAs表达出现显著差异,并通过对差异表达miRNAs靶基因及信号通路的调控参与失重条件下内皮细胞生理功能的特异性调节。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R85
【部分图文】：

miRNA测序流程图

miRNAs 与氧化应激情况下失重环境对内皮细胞凋亡发生相关，后续将对其靶基因展开生物信息分析。图2 模拟失重和氧化应激后EA.hy926细胞中hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表达变化注:*P<0.05, **P<0.01, ***表示P<0.001，n=12。讨 论随着科学研究中对低成本测序的高需求推动了高通量第二代测序技术的发展，因该技术使测序过程并行化，可同时产生数千或数百万个基因序列[24]。是研究miRNA对生物学影响的有力工具。但该技术还存在下述缺点：进行碱基替换的步骤及读取长度在200bp-500bp的碱基长度时易产生测序错误，使测序结果易出现假阳性，降低了测序结果的可信度。荧光定量PCR技术具有灵敏度、特异度较高的优点，其技术原理是通过荧光信号与目的产物拷贝数之间的关系计算基因的表达量，在本实验中可精确检测miRNAs表达量。因此，本课题对经miRNA测序筛选出的有意义的差异表达的miRNAs

图3 miR-29b-3p、miR-200c-3p靶基因富集的生物过程（二）细胞组分（Cellular Component）miR-29b-3p 和 miR-200c-3p 差异基因功能富集分析分别得到到 8 个细胞组分亚层（图 4）。这 2 个 miRNAS 的差异表达基因均显著富集于：细胞连接
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本文编号：2870093