重组人卵膜糖蛋白3的表达、抗体制备及与精子体外结合的研究

发布时间：2020-11-16 23:25

　　 研究目的:哺乳动物配子间的识别始于卵透明带(zona pellucida,ZP)与精子之间的结合。人类的ZP主要由四种糖蛋白组成,分别是ZP1,ZP2,ZP3和ZP4。其中,人卵膜糖蛋白3(h ZP3)作为精卵结合的初始受体,在诱导精子顶体反应的同时也表现出与精子较强的结合能力。由于天然h ZP3较难获取,目前大多数研究集中在重组h ZP3体外与获能精子的结合,但尚未有关于原核表达h ZP3体外与未获能精子结合的相关研究报道,同时,国内针对抗h ZP3全长特异性抗体的研究较少。因此,依据精卵结合的特性以及精卵受体配体间的相互作用,本研究欲通过原核表达的重组h ZP3体外与未获能精子的结合,为本课题组后续在法医学领域从混合斑中提取精子细胞提供应用基础;以及利用纯化后的重组h ZP3为抗原,制备抗h ZP3抗血清,为后续实验提供材料基础。研究方法:利用构建的p GEX-4T-1-h ZP3-His原核表达质粒,通过大肠杆菌诱导表达出h ZP3-GST-His融合蛋白;利用谷胱甘肽琼脂糖树脂(GST Resin)亲和层析纯化该蛋白。利用纯化后的h ZP3免疫新西兰白兔制备抗血清,分别采用ELISA和蛋白免疫印迹分析检测兔抗血清效价及特异性。纯化后的h ZP3与未获能精子体外结合,通过免疫荧光技术检测h ZP3与精子共定位,利用抑制实验检测h ZP3与精子的结合效率。实验结果:1、在大肠杆菌中成功表达出h ZP3-GST-His融合蛋白;纯化得到分子质量约为73 k Da的特异性的重组h ZP3;2、以纯化后重组h ZP3免疫新西兰白兔获得抗h ZP3的高效价粗制多克隆抗血清,但特异性较差;3、免疫荧光结果未发现原核表达的重组h ZP3在体外与未获能精子进行结合;抑制实验结果显示重组h ZP3与精子呈现出一定程度的结合趋势。结论:成功表达并纯化出重组hZP3;制备的兔抗hZP3的抗血清抗体效价较高,但特异性较差;重组h ZP3在体外与未获能人精子显示出较弱的结合。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：D919.4
【部分图文】：

A 组加入 1：5000 稀释的羊抗鼠 IgG（HRP）每孔 100 μl； 1：5000 稀释的羊抗兔 IgG（HRP）作为二抗，每孔 100 μl；37℃下反应之后操作与 2.2.3.2 一致。3 实验结果 重组 hZP3 的诱导表达及纯化结果1 pGEX-4T-1(+)- hZP3 重组质粒的酶切鉴定结果按上述实验方法，经 1%琼脂糖电泳后，酶切后重组质粒产生两条亮带，分bp 和 2252bp（如图 1 所示）。经比对质粒、hZP3 的序列，酶切位置与理符，结果表明该原核表达载体 pGEX-4T-1-hZP3 构建成功，可用于后续实

中国医科大学硕士学位论文3.1.2 大肠杆菌 BL21（DE3）成功表达重组 hZP3转化重组质粒 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的大肠杆菌 BL21（DE3）经不同的 IPTG 浓度（0.5、1.0、1.5mM）（图 2）、诱导时间（4、6h）（图 3）和诱导温度（28℃、37℃）（图 4）进行诱导条件摸索，优化出最佳表达条件。结果如图 2~4 所示，总体分析可得重组菌 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的最佳 IPTG 诱导浓度为 1.5mM，诱导时间为 6 h，诱导温度为 28℃。

37℃）（图 4）进行诱导条件摸索，优化出最佳表达条件。结果如图 2~4 所示，总体分析可得重组菌 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的最佳 IPTG 诱导浓度为 1.5mM，诱导时间为 6 h，诱导温度为 28℃。图 2 在 0.5、1.0、1.5mM IPTG 诱导浓度下重组菌表达蛋白的免疫印迹分析M：蛋白 Marker；泳道 1-1，2-1，3-1 分别是在 IPTG 诱导浓度为 0.5、1.0、1.5mM 时的破菌后上清，泳道 1-2，2-2，3-2 分别是在 IPTG 诱导浓度为 0.5、1.0、1.5mM 时的破菌后沉淀。
【参考文献】

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1 卢慧;刁华;肖玉芳;于合国;李铮;施惠娟;;昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究[J];中华男科学杂志;2014年11期

本文编号：2886784