人类指甲游离缘DNA的提取方法与影响因素的研究

发布时间：2020-11-16 18:38

　　目的:本研究通过实验探究验证Chelex-100联合吸附柱法提取指甲游离缘DNA的可行性,分析各种影响因素对指甲游离缘DNA提取与STR分型的影响结果以建立指甲游离缘最佳的提条件;在最佳提取条件下,通过大量样本实验验证其可行性。通过大量样本DNA浓度的数据分析对指甲游离缘DNA含量进行定量分析,来确定其含量。方法:指甲游离缘DNA提取采用去离子水与10%SDS缓冲液清洗结合无菌手术刀刮取等方法清洁与粉碎指甲游离缘,利用Chelex-100与吸附柱联合提取指甲游离缘DNA,利用5色荧光Powerplex(?)21 System PCR扩增试剂盒、96孔梯度PCR扩增仪和ABI 3100-Avant基因分析仪分别进行PCR扩增和基因分型。设指甲游离缘的干燥时间(5min、7min、10min、12min、15min、17min)、消化时间(2h、6h、10h、14h、18h、24h)、质量(3mg、10mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg)、厚度(0.35mm、0.40mm、0.45mm、0.50mm、0.55mm、0.60mm)、Chelex-100 浓度(1%Chelex-100、2.5%Chelex-100、5%Chelex-100、7.5%Chelex-100、10%Chelex-100)作为影响因素,建立最佳提取条件。在最佳提取条件下对正常样本(50份),涂有指甲油的样本(6份)与脚趾甲样本(6份)进行提取与基因分型。利用Nanodrop2000对50个指甲游离缘样本进行DNA浓度测量,确定指甲游离缘内部DNA含量;利用5%Chelex-100对50人静脉血液样本(对照)进行提取;利用GeneMapperID v3.2基因分析软件、EXCEL 2007及SPSS 21.0进行基因分析和统计学分析。结果:用Chelex-100联合吸附柱法成功提取高质量的指甲游离缘DNA,采用最佳的DNA提取条件,成功检测到所有基因座的分型。在干燥时间影响因素中,5分钟以上DNA图谱完整,无等位基因缺失,RFU值与干燥时间成正相关,当干燥时间超过15分钟时TH01,VWA,D8S1179,D12S391基因座会出现较多杂峰,故选择干燥时间10分钟为最佳干燥时间;在消化时间影响因素中,时间为2h,6h,10h时分别缺失2、1、1个等位基因,2h时还伴有Amelogenin基因座不平衡峰的出现,14h时基因座PENTAE,PENTAD有不平衡峰出现,18h,24h无等位基因缺失,等位基因峰均衡性好,24h基因座基因RFU值峰值最高,故选择24h为最佳消化时间;在质量影响因素中,质量为3mg,10mg时分别缺失17个,12个等位基因,在14mg以上时显示完整的基因图谱,峰型稳定;厚度影响因素中,0.35mm、0.40mm厚度的指甲样品中存在分别缺失5个和1个等位基因的现象,0.45mm开始出现完整的图谱;在Chelex-100浓度影响因素中,Chelex-100浓度为1%,2.5%时DNA-STR分型图谱中分别缺失22,16个等位基因,Chelex-100浓度在5%以上时DNA-STR分型图谱完整无等位基因缺失。利用7.5%Chelex-100提取的DNA浓度最高,STR分型图谱与10%Chelex-100图谱相差无几,故Chelex-100浓度为7.5%-10%时最佳。50份样本指甲游离缘样本、6份涂有指甲油的样本和6份脚趾甲样本在此种方法最佳条件下成功提取DNA并进行STR基因分型,50份样本指甲游离缘样本与静脉血对照组DNA分型完全一致。指甲游离缘内含有的DNA量大约是28.15±5.81ng/mg。结论:Chelex-100联合吸附柱可行并且适合指甲游离缘DNA提取;通过本研究,确定最终最佳DNA提取条件确定为质量14mg以上、厚度0.45mm以上、消化时间24h、100℃干燥1Omin、Chelex-100浓度为7.5%-10%;本研究结果为人类指甲游离缘DNA的法医学鉴定提供有价值的实验依据。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：D919
【部分图文】：

电泳图谱,基因座,干燥时间,折线图

３．１各个影响因素下ＳＴＲ分型图谱结果??运用基因分析软件ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ?ＩＤ?ｖ３．２得到不同影响因素的基因图谱。??Ａ组不同的干燥时间的电泳结果见图１－图６，?１０（ＴＣ干燥条件下不同干燥时间??等位基因无缺失，从表２，图７可以看出，随着时间的增长各个基因座下的ＲＦＵ??值也变大，ｌ〇〇°Ｃ?１５分钟时处于图的最顶端其次是１７分钟时。绿色折线（１００°Ｃ??１０分钟）大约处于折线图的中间，ｌ〇〇°Ｃ?５分钟的折线图基本处于折线图的最底??端；小片段基因座?Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、ＴＨ０１、Ｄ８Ｓ１１７９??的ＲＦＵ值处于２０００－７０００之间，Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２Ｓ１３３８、ＣＳＦ１Ｐ０、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ８Ｓ１１７９、??Ｄ１２Ｓ３９１?的?ＲＦＵ?值处于?１０００?左右，大片段?ＰＥＮＴＡＥ、ＰＥＮＴＡＤ、ＴＰＯＸ、ＦＧＡ??的ＲＦＵ均值约５５０。当干燥时间超过１５分钟时ＴＨ０１、ＶＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１２Ｓ３９１??基因座会出现较多杂峰。??ｔｏｏ?ＺＯＯ?３００?４００??７０００?＊??１００：Ｌ?Ｉ?ＩａＡ?；?１１．??匕??：??ｉｉ?Ｈｉ?ｉｓ?ｉｌ?Ｓ?窗??ｉ．ｆｓａ?ＳｍｉＡ?Ｐｉｈｊ４ｉ＃＊ＰＩ＊ｘ＿Ｚ１＿ｗ２－０?ｉ?ｇ??切ＳＳＳ３９?ｇ＞２Ｓ１３３８?．?????＂：?；??１０Ｑ?２００?３００?４〇ａ??ｉ?

基因座,峰值

表２：?１００°Ｃ千燥时间下各基因座ＲＦＵ峰值??１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ￣??５?ｍｉｎ?７ｍｉｎ?ｌＯｍｉｎ?Ｉ２ｍｉｎ?Ｉ５ｍｉｎ?Ｉ７ｍｉｎ??Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ?２２３４?３５８１?３５９７?２５８０?６６０７?６３５４＾??１９５２?３６５６?３８７８?２５８０?６７３８?６２０４??Ｄ３Ｓ１３５８?１３０９?２２１８?１７２７?２４６４?５４２９?４５５９??２１６８?３３６５?２８４９?３０２７?６６０７?４００１??Ｄ１Ｓ１６５６?１０６７?８９８?１２１０?１４６９?２７２１?２４９３??８７０?８６６?７７５?６７５?２７２１?１３８８??Ｄ６Ｓ１０４３?６３９?１１０６?９８５?９１８?２３２５?２０２９??５６９?８２７?１０６４?６３６?２１２７?１６０２??Ｄ１３Ｓ３１７?６３３?４３３?１０３８?９３５?２３２５?１９５８??６３３?４３３?１０３８?９３５?２３２５?１９５８??ＰＥＮＴＡＥ?１４３?２０５?４３３?３５２?６７２?７５７??

电泳图,电泳图,硕士学位论文