束缚应激加重挤压伤大鼠蓝斑损伤中儿茶酚胺的作用

发布时间：2017-04-12 05:20

  本文关键词：束缚应激加重挤压伤大鼠蓝斑损伤中儿茶酚胺的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:在司法实践中,经常遇到各种各样的非致命性机械性损伤后发生死亡的案件,如虐待、非暴力刑讯逼供后经历一段时期后死亡。由于此类损伤本身不足以导致当事人死亡,因此死亡原因往往不能确定,导致案件久拖不决,严重影响国家司法公信力。因此揭示非致命性机械性损伤致死的机制是法医学亟待解决的科学技术问题。此类损伤对机体造成的影响除了局部组织损伤,或进一步引起远隔器官的损伤以及全身性炎症反应等还可以引起机体强烈的应激反应。应激反应的生理意义是维持机体稳态,具有重要的防御代偿意义。但是如果应激原过于强烈或持久,则会导致机体的功能异常、代谢障碍及组织损伤[1]。上述非致命性机械性损伤引起的病理性损害以及当事人遭受损伤后产生的紧张、恐惧及抑郁等负面情绪,都可以作为应激原引起机体强烈的应激反应。阐明应激对机体各系统的损伤作用对于揭示非致命性机械性损伤导致死亡的机制具有重要意义。蓝斑是中枢神经系统对应激最敏感的部位,其中去甲肾上腺素能神经元具有广泛的上、下行纤维联系。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺合成过程中的限速酶[2]。应激时,TH表达水平增加,儿茶酚胺分泌增多成为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统产生中枢效应和外周效应的主要物质基础。蓝斑与延髓呼吸、心血管中枢关系密切,蓝斑神经元的广泛破坏,会导致呼吸衰竭、心脏骤停,甚至猝死[3,4]。因此研究过度应激对蓝斑形态和功能的影响对于揭示应激与死亡的因果关系具有非常重要的意义。儿茶酚胺由突触前膜释放后被重摄取,经单胺氧化酶氧化后产生醛类物质。此种醛类物质可引起神经元损伤及凋亡。那么过度强烈的应激是否会引起蓝斑损伤,这种损伤作用是否与儿茶酚胺有关,目前尚未见文献报道。本研究拟建立束缚应激加挤压伤的复合模型观察心理应激原和躯体应激原双重打击对大鼠蓝斑造成的损伤作用以及儿茶酚胺在其中的作用,为阐明儿茶酚胺在应激性损伤中的作用,揭示非致命性损伤致死的分子机制提供实验依据。方法:1 Sprague Dawley(SD)大鼠162只,雄性,体重240~260g,于控制条件下适应性喂养一周后,应用随机数字表随机分为6组(每组27只大鼠)。①对照组:每日8h或10h交替禁食水,其余时间自由活动。②束缚应激组:每天将大鼠于固定时间放入束缚应激模具内,束缚时间为每日8h或10h,交替进行。③挤压组:大鼠用乙醚麻醉后,于双后肢上压24 kg重物,连续挤压6小时,此后每日不再进行挤压,在相应时间禁食水。④复合模型组:大鼠用乙醚麻醉后,实施挤压6小时,然后于当日(24点-次日8点)进行束缚,此后每日于固定时间(8h或10h交替)进行束缚。⑤复合模型+酪氨酸羟化酶抑制剂(alpha-methyl-p-tyrosine,AMPT)组:大鼠在每日挤压或束缚应激前2小时腹腔注射AMPT,连续注射7d。⑥单纯AMPT组:每日于相同时间给大鼠腹腔注射AMPT,连续注射7d。除复合模型+AMPT组和单纯AMPT组于造模7d处死大鼠,其余各组均于造模1d、3d、5d、7d处死大鼠,取材进行实验观察。造模后腹腔注射麻醉,取血,-80°保存备用,后于冰上迅速取出大脑放入固定液中固定。每组于造模不同时间各取6只大鼠脑组织进行硫堇染色观察脑组织病理学改变,同时应用免疫组织化学染色方法观察脑组织中c-Fos、Caspase-3以及磷酸化的TH蛋白表达的变化。此外各组剩余3只大鼠于造模结束在透射电镜下观察蓝斑神经元形态。2数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较,以P0.05为有显著统计学差异。结果:1大鼠体重变化对照组体重逐渐增加,与对照组相比,束缚应激组体重增长缓慢,复合模型组于挤压第二天体重下降,随后有所升高,但是与对照组相比增长缓慢,具有显著性差异,此结果表明束缚应激模型成功建立。2大鼠血浆中E、NE浓度变化造模1d、3d,挤压组E、NE浓度均较对照组升高,与挤压组相比,复合模型组进一步升高;而随挤压后时间延长即造模5d、7d,挤压组二者浓度与对照组相比无统计学差异。但与挤压组相比,复合模型组E、NE浓度仍显著升高。3蓝斑组织磷酸化的TH免疫组织化学染色结果磷酸化的TH蛋白表达变化趋势与血浆中E、NE浓度变化大致相同,结合血浆中E、NE浓度的变化趋势,本文认为双重应激原引起的应激反应强度远高于单纯挤压引起的应激反应强度。4脑组织蓝斑位置硫堇染色本研究通过比较造模不同时间蓝斑组织硫瑾染色结果发现,造模7d时损伤最为严重。结果显示,对照组接近正常蓝斑神经元表现。与对照组相比,挤压组出现不同程度水肿、变形。束缚应激组除了可见水肿、变形、还可见神经元排列紊乱、固缩等病理改变。与挤压组相比,复合模型组的病理学变化更加明显,神经元固缩,排列紊乱程度加重。而预先应用AMPT可明显减轻挤压和束缚双重打击造成的损伤,表明束缚应激可加重挤压伤大鼠蓝斑损伤,机制可能与儿茶酚胺合成限速酶TH过度激活有关5蓝斑组织c-Fos蛋白免疫组织化学染色结果造模1d、3d、5d各组未见阳性表达。造模7d各组c-Fos免疫组化染色结果如下:对照组、挤压组无阳性表达,束缚应激组出现阳性表达,复合模型组阳性表达增强。而在造模之前预先应用AMPT可使c-Fos阳性表达转变为阴性表达。6蓝斑组织caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果和电镜结果造模1d、3d、5d各组均未见阳性表达。造模7d仅在复合模型组观察到阳性表达,其余各组偶见阳性表达。而在造模之前预先应用AMPT可使caspase-3阳性表达转变为阴性表达,表明挤压后束缚应激7d可能引起了蓝斑神经元凋亡。电镜结果如下:对照组和挤压组轻度水肿表现。束缚应激组有中重度水肿表现。复合模型组出现早期凋亡表现。复合模型+AMPT组细胞超微结构改变较复合模型组减轻,与caspase-3结果一致,提示束缚应激和挤压伤共同刺激可引起蓝斑神经元凋亡,机制可能与儿茶酚胺合成限速酶TH过度激活有关。结论:本研究成功建立了大鼠束缚应激和挤压伤的复合模型,通过观察蓝斑神经元组织病理学和超微结构改变、ELISA方法检测血浆中E、NE浓度变化、免疫组织化学检测磷酸化的TH、c-Fos和Caspase-3蛋白表达得出以下结论:束缚应激可以加重挤压伤大鼠蓝斑的损伤,诱导神经元凋亡,其机制与儿茶酚胺合成限速酶TH过度激活,CA产生增多有关。
【关键词】：应激 儿茶酚胺 蓝斑 束缚 挤压 酪氨酸羟化酶
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14
• 材料与方法14-23
• 结果23-26
• 附图26-42
• 附表42-45
• 讨论45-48
• 结论48-49
• 参考文献49-52
• 综述 应激时蓝斑对机体各系统的影响52-63
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 个人简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 闫胜男;韩芳;石玉秀;;大鼠PTSD后蓝斑核β-catenin的表达下降伴随细胞凋亡[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2012年01期

2 张栋益;康深松;徐军;;氧自由基与皮瓣缺血再灌注损伤[J];中华实用诊断与治疗杂志;2014年04期

3 颜玲;黄德彬;刘锦红;周庆华;;黄芪多糖对局部缺血/再灌注所致大鼠大脑皮层c-fos和Bcl-2表达的影响[J];中国药理学通报;2012年12期

  本文关键词：束缚应激加重挤压伤大鼠蓝斑损伤中儿茶酚胺的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：300816