RCCS模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞影响的实验研究

发布时间：2017-04-15 20:11

  本文关键词：RCCS模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞影响的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的我国载人航天工程已处于关键时期,要实现长期驻留太空的目标,维持航天员的健康、安全和高效的工作能力至关重要。失重是制约人类长期驻留太空的主要因素,一方面失重使机体发生一系列生理病理变化,包括骨质减少、肌肉萎缩、心血管紊乱和免疫功能低下等,另一方面失重会导致微生物生物学特性改变,多方面的因素增加了航天员患感染性疾病的风险。肝脏是人体重要的生化代谢、解毒和免疫器官,枯否细胞(Kupffer Cells,KCs)是肝脏的巨噬细胞,是全身单核-吞噬细胞系统的重要组成部分,具有吞噬、分泌和免疫功能,在全身尤其是肝脏疾病发生发展中起到重要作用。模拟微重力条件下肝KCs的研究尚未见报道。本实验采用RCCS培养系统(Rotary Cell Culture System,RCCS)作为微重力模型,探讨失重对肝脏KCs的影响,旨在为当前及今后载人航天飞行中出现的相关医学问题提供对策思路和科学依据。研究方法采用RCCS培养系统建立小鼠肝KCs模拟微重力培养体系,将小鼠肝原代KCs随机分为模拟微重力(simulated microgravity,SMG)组和正常重力(normal gravity,NG)组,SMG组旋转器轴心与地面平行,NG组回转器轴心与地面垂直。倒置相差显微镜下观察小鼠肝KCs的形态和生长情况,于培养第3 d、5 d、7 d收获细胞,血球计数板细胞计数,流式细胞仪检测小鼠肝KCs的细胞周期,qPCR和Western Blotting技术分别检测小鼠肝KCs的PCNA、Ki-67、ERK、CDK2及Cyclin B基因和蛋白表达水平,扫描电镜观察小鼠肝KCs的表面结构,透射电镜观察小鼠肝KCs超微结构,激光共聚焦显微镜观察小鼠肝KCs细胞微丝骨架荧光强度的变化。结果细胞计数显示,培养第3 d时SMG组明显低于NG组(2.59±0.13 vs.3.10±0.15,p0.05),培养第5d、7d时smg组明显高于ng组(6.92±0.35vs.5.87±0.17,p0.05;8.41±0.27vs.6.54±0.26,p0.05)。流式细胞仪检测结果显示,培养第3d时smg组g0/g1期明显高于ng组(78.10±0.22vs.59.69±1.19,p0.05),s期、g2/m期明显低于ng组(11.97±0.43vs.27.63±0.88,p0.05;9.93±0.27vs.12.68±0.42,p0.05);培养第5d时,smg组g0/g1期低于ng组(69.52±1.48vs.74.83±0.66,p0.05),s期、g2/m期高于ng组(21.18±1.47vs.17.25±0.36,p0.05;9.30±0.37vs.7.92±0.38,p0.05);培养第7d时,smg组g0/g1期依然低于ng组(73.86±1.91vs.81.70±1.29,p0.05),s期、g2/m期亦高于ng组((18.88±1.94vs.12.07±0.84,p0.05;26±0.24vs.6.23±0.55,p0.05)。qpcr结果显示,与ng组相比,smg组pcna、ki-67、erk、cdk2以及cyclinb基因表达在培养3d时均下调,5d和7d时呈现明显上调趋势。westernblotting检测结果显示,小鼠肝kcs培养3d时,与ng组相比较,smg组的pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表达量均较低(p0.05);细胞培养5d时,smg组的pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表达量高于ng组(p0.05);模拟微重力7d时,pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表达量进一步变化,蛋白表达量明显高于ng组(p0.05)。扫描电镜结果显示,ng组和smg组的小鼠肝kcs贴附在微载体上,细胞呈椭圆形或圆形或梭形,细胞表面有很多细胞突起,细胞与细胞之间相互连接聚集成团,细胞伸出细细的伪足或伞形贴于微载体表面,随着时间的延长,微载体上贴附的细胞逐渐增多,尤其是第7d微载体上的细胞最多,ng组与smg组细胞表面结构无明显差异。透射电镜结果显示,rccs模拟微重力培养小鼠肝kcs5d时,ng组粗面内质网中度扩张,线粒体固缩;smg组粗面内质网轻微扩张外未见明显异常;7d时,ng组粗面内质网扩张更加明显,部分细胞线粒体肿胀、空化;smg组粗面内质网轻度扩张,线粒体出现固缩。激光共聚焦微丝荧光强度结果显示,小鼠肝kcs培养第3d时,smg组的荧光强度相对于ng组较弱,随着时间的延长,ng组和smg组的荧光强度均有所降低,ng组的荧光强度衰退相对于smg组明显,在第5dsmg组的荧光强度高于ng组,至第7d时smg组的荧光强度明显优于ng组。结论在RCCS模拟失重应激损伤期,小鼠肝KCs的增殖功能受到抑制,一定时相后其增殖能力在相关基因蛋白的参与调节下得以恢复并被激活强化。在模拟微重力条件下,小鼠肝KCs的形态和超微结构亦发生变化。模拟微重力影响小鼠肝KCs增殖、形态和超微结构的机制有待进一步研究。
【关键词】：模拟微重力 RCCS 肝脏 枯否细胞 增殖 超微结构
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 小鼠肝Kupffer细胞RCCS微载体培养体系的建立15-24
• 引言15
• 材料与方法15-21
• 结果21-22
• 讨论22-24
• 第二部分 RCCS模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞增殖影响的研究24-51
• 引言24
• 材料与方法24-34
• 结果34-48
• 讨论48-51
• 第三部分 模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞形态和超微结构的影响51-59
• 引言51
• 材料与方法51-53
• 结果53-57
• 讨论57-59
• 全文结论59-62
• 参考文献62-66
• 个人简历66-67
• 致谢67-68
• 综述68-79
• 参考文献74-79

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