重组人ZP3与精子体外结合的研究和三个常染色体InDel多态性调查

发布时间：2023-04-28 18:53

　　目的:法医物证检验涉及到最常见的生物检材之一是精液和阴道液混合斑,从混合斑中分离出男性的特有成分精子是目前性犯罪案件的难点。针对混合斑分离精液和阴道液组分进行检测以及精液特有成分检测的方法有多种,但是有时会因为女性成分如阴道上皮细胞数量远多于精子数量,造成了获得精子难度提升,或者即使获得但是精子不完整或者并非单一成分,这导致后续提取精子DNA难度加大,更无法进行个人识别鉴定。卵膜糖蛋白,也叫透明带(zona pellucida,ZP)是一种包裹在哺乳动物卵母细胞周围的糖蛋白半透明基质,在受精过程中起着至关重要的作用。在人类中,ZP由四种糖蛋白组成,分别为ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。其中,hZP3是精卵识别结合的初级受体,在受精过程中,与精子结合,诱发精子一系列反应,包括精子膜活化、酪氨酸磷酸化和顶体反应等,在精卵结合、顶体反应、防止多精入卵以及保护卵细胞和着床前的胚胎等方面发挥着重要的作用。hZP3的功能肽段,氨基酸序列214-305aa,(命名为Truncated ZP3(TrZP3))是诱导精子顶体反应的关键肽段。研究已经证明重组hZP3和TrZP3在结构和功能上与天然ZP3接...

【文章页数】：89 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:重组人卵膜糖蛋白3在真核细胞中的表达及与精子体外结合的探讨
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料与试剂
            2.1.1 实验样品
            2.1.2 主要试剂与耗材
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 重组质粒DNA提取和酶切验证
            2.2.2 真核细胞HEK293 培养
            2.2.3 真核细胞HEK293 转染
            2.2.4 细胞蛋白提取和浓度测定
            2.2.5 hZP3 纯化
            2.2.6 hZP3 蛋白免疫印迹法检测
            2.2.7 纯化hZP3 ELISA法检测
            2.2.8 精子样品制备
            2.2.9 纯化hZP3 与精子体外结合检测
    3 结果
        3.1 重组hZP3 蛋白在真核细胞中成功表达
            3.1.1 重新培养的细菌经裂解纯化后成功获得重组质粒
            3.1.2 重组质粒在真核细胞中得到高效表达
            3.1.3 利用标签蛋白纯化获得了hZP3-His融合蛋白
        3.2 重组hZP3 蛋白与精子体外结合
            3.2.1 纯化的hZP3-His融合蛋白与特异性抗体结合具有剂量效应
            3.2.2 纯化的hZP3-His融合蛋白与精子体外未观察到明显结合
    4 讨论
        4.1 融合蛋白hZP3-His在真核细胞HEK293 中的表达
        4.2 融合蛋白hZP3-His与精子体外结合的探究
    5 结论
第二部分:稳定表达人ZP3(214-305aa)CHO系的建立及ZP3(214-305aa)与精子体外结合的研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料与试剂
            2.1.1 实验样品
            2.1.2 主要试剂与耗材
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 重组质粒DNA的提取
            2.2.2 真核细胞CHO-K1 培养
            2.2.3 稳定CHO-TrZP3 细胞系构建
            2.2.4 TrZP3 蛋白免疫印迹法检测
            2.2.5 稳定CHO-TrZP3 细胞荧光显微镜观察
            2.2.6 稳定CHO-TrZP3 细胞免疫荧光法检测
            2.2.7 TrZP3 纯化
            2.2.8 纯化TrZP3 ELISA法检测
            2.2.9 纯化TrZP3 与梯度精子体外结合检测
            2.2.10 纯化TrZP3 与精子体外梯度时间结合检测
    3 结果
        3.1 稳定表达hZP3(214-305aa)CHO细胞系构建成功
            3.1.1 重组质粒在真核细胞CHO中得到稳定表达
            3.1.2 稳定CHO-TrZP3 细胞生长状态良好
            3.1.3 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His在稳定细胞的胞质中均匀表达
            3.1.4 利用His标签蛋白纯化获得了融合蛋白EGFP-TrZP3-6His
        3.2 hZP3(214-305aa)与精子体外结合
            3.2.1 纯化获得的融合蛋白与抗GFP抗体结合表现出剂量效应
            3.2.2 纯化的融合蛋白与梯度精子在体外未检测到结合
            3.2.3 纯化的融合蛋白与精子体外孵育不同时间未检测到结合
    4 讨论
        4.1 稳定细胞系构建和融合蛋白EGFP-ZP3-6His表达
        4.2 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His与精子体外结合的研究
    5 结论
第三部分:三个常染色体InDel遗传标记的多态性调查及与帕金森病相关性分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 研究对象
        2.2 实验材料和试剂
            2.2.1 主要试剂与耗材
            2.2.2 主要仪器
        2.3 实验方法
            2.3.1 基因组DNA分离和基因分型
            2.3.2 GIGYF2 的毛细管电泳
            2.3.3 DNA测序
            2.3.4 统计学分析
    3 结果
        3.1 ACE和 DJ-1 InDel多态性的基因分型
        3.2 GIGYF2 基因的InDel与 PD相关
        3.3 PD相关的InDel基于性别的遗传分布差异
        3.4 三个 InDel 位点的法医学参数
    4 讨论
        4.1 三个InDel遗传标记的法医学意义
        4.2 三种不同的InDel与 PD关联性
            4.2.1 ACE的 InDel多态性与PD关联性
            4.2.2 DJ-1的InDel多态性与PD关联性
            4.2.3 GIGYF2的InDel多态性与PD关联性
            4.2.4 三种InDel多态性性别分层与PD关联性
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3804276