模拟微重力恢复培养对HUVEC-C细胞增殖抑制的研究

发布时间：2017-09-22 12:21

  本文关键词：模拟微重力恢复培养对HUVEC-C细胞增殖抑制的研究

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【摘要】：空间微重力导致宇航员发生心血管功能障碍,可能与血管内皮细胞的功能紊乱有关。但宇航员返回到地面1g后,微重力产生的损伤效应如何调整,哪些效应能够恢复、哪些机制参与其中仍不清楚。本研究利用旋转式细胞培养系统(RCCS-1)对脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-C)进行模拟微重力处理,比较分析模拟微重力处理和恢复培养对HUVEC-C产生细胞生物学变化的特点,分析了相关的miRNA及其靶基因,以解析这些miRNA参与微重力诱导细胞生物学效应的可能机制。本研究利用细胞与微载体共培养的方法,使HUVEC-C细胞完全贴附于微载体上。在模拟微重力处理贴附微载体上的HUVEC-C到6h时,发现细胞骨架微丝解聚,但继续处理24h和48h微丝又恢复正常,提示微重力能引起细胞骨架发生重构。恢复培养后,在24h细胞骨架再次发生变化,微丝解聚,当继续培养48h后细胞骨架恢复正常。模拟微重力48h后,细胞发生了细胞周期G2期阻滞,但恢复培养48h,周期阻滞现象消失。使用SA-β-gal染色法,对细胞老化情况进行分析发现模拟微重力48h促进了细胞的老化。模拟微重力48h恢复培养48-96h细胞增殖明显受到抑制,细胞的粘附能力在恢复培养早期(2h,4h)受到影响降低,逐渐恢复正常；恢复培养晚期(72h、96h),细胞凋亡率升高,说明模拟微重力恢复重力后HUVEC-C细胞增殖抑制可能是早期细胞粘附能力降低、细胞骨架重构和晚期细胞凋亡综合作用的结果。为进一步分析miRNA是否参与微重力恢复培养后发生的细胞生物学变化,本研究测定了三种miRNA(miR-1, miR-22和miR-34a)在模拟微重力处理和恢复培养后的表达变化。研究发现模拟微重力处理可以导致miR-1, miR-22和miR-34a表达上调,而在模拟微重力后不同时间点这三种miRNA表达趋势明显不同,通过Q-PCR和Western Blot进行验证,证明miR-22和miR-34a分别通过靶基因SIRT1和BCL2发挥作用。此外,细胞凋亡过程有PTEN, Apaf-1参与,提示可能通过PTEN-PI3K-Akt和p53-Apaf-1信号通路介导。本研究对评价宇航员返回地球后的身体状态有重要的意义,并对于太空飞行的风险评估有一定的参考价值。
【关键词】：模拟微重力 细胞骨架 细胞周期 细胞粘附 细胞凋亡 miRNAs
【学位授予单位】：大连海事大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-23
• 1.1 微重力环境及其对人体的影响10-12
• 1.1.1 微重力环境10
• 1.1.2 微重力环境对人体的影响10-12
• 1.2 模拟微重力的实验方法12-13
• 1.3 微重力对细胞的影响及机制研究13-18
• 1.3.1 微重力对细胞形态结构的影响14-15
• 1.3.2 微重力对细胞增殖的影响15
• 1.3.3 微重力对细胞周期的影响15-16
• 1.3.4 微重力对细胞凋亡的影响16
• 1.3.5 微重力对细胞老化的影响16-17
• 1.3.6 微重力对细胞信号转导和细胞功能的影响17-18
• 1.4 微重力对血管内皮细胞的影响18
• 1.5 微重力后恢复培养的研究18-19
• 1.6 微重力环境影响miRNA表达水平变化研究现状19-22
• 1.6.1 miRNA的简介及其生物合成19-20
• 1.6.2 miRNA对基因表达的调控作用及其功能20-21
• 1.6.3 miRNA受微重力环境影响表达水平的变化21-22
• 1.7 本研究的目的及意义22-23
• 第2章 实验材料和方法23-43
• 2.1 实验材料23-27
• 2.1.1 细胞培养23
• 2.1.2 实验设备及仪器23-24
• 2.1.3 主要试剂24-25
• 2.1.4 试剂配制25-27
• 2.2 实验方法27-43
• 2.2.1 模拟微重力处理27-28
• 2.2.2 模拟微重力后恢复重力处理28-29
• 2.2.3 细胞增殖曲线测定29
• 2.2.4 细胞粘附能力检测29
• 2.2.5 细胞骨架免疫染色29-30
• 2.2.6 细胞周期测定30-31
• 2.2.7 细胞老化染色31
• 2.2.8 细胞凋亡率检测31
• 2.2.9 RNA提取31-32
• 2.2.10 qRT-PCR检测miRNA表达水平32-34
• 2.2.11 qRT-PCR检测基因表达水平34-37
• 2.2.12 Western Blot检测蛋白表达水平37-42
• 2.2.13 数据分析处理方法42-43
• 第3章 结果与讨论43-64
• 3.1 模拟微重力实验方法确立43-45
• 3.1.1 贴壁细胞HUVEC-C进行模拟微重力实验方法的确定43-44
• 3.1.2 微载体对细胞粘附能力影响的测定44-45
• 3.2 模拟微重力对HUVEC-C的影响45-50
• 3.2.1 模拟微重力对HUVEC-C细胞骨架的影响45-46
• 3.2.2 模拟微重力对HUVEC-C细胞周期的影响46-48
• 3.2.3 模拟微重力对HUVEC-C细胞老化的影响48-49
• 3.2.4 模拟微重力对HUVEC-C细胞相关miRNA表达的影响49-50
• 3.3 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C的影响50-64
• 3.3.1 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C细胞增殖的影响50-52
• 3.3.2 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C细胞粘附能力的影响52
• 3.3.3 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C细胞骨架的影响52-54
• 3.3.4 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C细胞周期的影响54-56
• 3.3.5 模拟微重力后恢复培养对HUVEC-C细胞凋亡的影响56
• 3.3.6 模拟微重力后恢复培养对miRNA表达的影响56-58
• 3.3.7 小结58-60
• 3.3.8 miRNA靶基因的预测及筛选60
• 3.3.9 模拟微重力后恢复培养对增殖相关基因的影响60-61
• 3.3.10 模拟微重力后恢复培养对调亡相关基因的影响61-64
• 第4章 结论与展望64-66
• 参考文献66-72
• 攻读学位期间公开发表论文72-73
• 致谢73-74
• 作者简介74

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本文编号：900795