模拟微重力效应对海藻酸钠三维培养心肌细胞的影响

发布时间：2017-10-16 05:15

  本文关键词：模拟微重力效应对海藻酸钠三维培养心肌细胞的影响

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【摘要】：微重力可致航天员在太空飞行过程中生理机能发生改变。这些变化主要包括心血管系统、肌肉系统、免疫系统和骨骼系统的病理性改变，其中心血管系统病理性改变是造成空间飞行过程中航天员不能顺利完成空间作业，甚至猝死的主要原因。因此，探讨微重力对心脏结构和功能的影响及其相关机制，可为进一步建立基于生物医学基础的有效防护措施提供理论基础，对于保证航天员在太空飞行时的健康和有效工作具有重要意义。 由于在空间进行微重力实验耗资大，机会有限，因此地面模拟微重力效应是目前空间生物学与航天医学研究的主要研究方式。为了克服模拟微重力效应研究中细胞二维培养的不足，本研究构建了一种新型的海藻酸钠微囊体，使细胞在该载体内呈三维生长，以保证尽可能实现在体细胞的特征。为了选择力学性能稳定，可以对抗回转过程产生的剪切力作用的载体材料，本实验首先利用流变仪检测了不同组成成分的海藻酸钠微囊体力学性能，结果显示1:30:0.05海藻酸钠/胶原/壳聚糖为最佳组成。扫描电镜显示微囊体为内部多孔结构，有利于细胞培养。其次，细胞增殖实验表明心肌细胞在该微囊体内的稳定增殖，原代心肌细胞在微囊体内可形成类心肌组织，并维持长期搏动。因此，海藻酸钠/胶原/壳聚糖微囊体包覆心肌细胞可用于后续微重力效应的相关研究。 为了进一步研究海藻酸钠微囊体用于模拟微重力效应研究的可靠性，本研究利用回转仪以转数15rpm回转培养24hr，比较海藻酸钠微囊体和cytodex微球为载体的心肌细胞微丝结构改变，发现两者微丝结构变化相似，此外不同表型的乳腺癌细胞在海藻酸钠微囊体中回转培养48hr后，乳腺癌细胞的生物学特性发生改变，表明海藻酸钠微囊体用于模拟微重力效应研究的可行性。 在构建以海藻酸钠微囊体为载体的细胞三维培养模型基础上，本文利用免疫荧光染色、MTT和流式细胞仪等方法研究了模拟微重力效应对心肌细胞结构、增殖和凋亡的影响，结果表明模拟微重力效应24hr导致三维培养的心肌细胞伪足消失，增殖能力降低，36hr出现早期凋亡，并在回转培养72hr时出现DNA损伤。 为了深入研究模拟微重力效应对三维培养的心肌细胞功能的影响及其相应机制，本研究还分析了心肌细胞搏动频率的变化，，通过显微镜观察海藻酸钠微囊体内心肌细胞的搏动频率，发现模拟微重力效应24hr可致原代心肌细胞收缩频率改变，表明模拟微重力效应改变三维培养的心肌细胞的搏动功能。同时利用实时定量PCR和Western-blot分析了模拟微重力效应与介导兴奋-收缩耦联的缝隙连接蛋白Connexin43以及影响心肌功能的离子通道蛋白（钠离子通道蛋白、L-钙离子通道蛋白、钠钾泵、钠氢交换体）表达变化的关系，研究结果提示模拟微重力效应对编码钠通道的基因SCN5a表达未造成明显影响，而其余通道蛋白均有不同程度的表达变化（Connexin43表达呈一过性改变，可产生适应性恢复；L-钙通道蛋白表达增高；钠钾泵和钠氢交换体表达降低），说明模拟微重力效应改变了动作电位产生的分子基础，从而导致心肌搏动功能改变。此外，尾悬吊大鼠实验也表明模拟微重力效应改变了心肌离子通道蛋白表达，其中Connexin43和钠氢交换体改变与体外培养的心肌细胞改变一致，而L-钙通道蛋白和钠钾泵表达与体实验相反，以上研究结果提示神经体液调控参与了模拟微重力效应下心肌组织离子通道蛋白的表达。 在以上研究的基础上，为了深入分析模拟微重力效应下线粒体氧化应激响应的协同变化，利用线粒体特异探针荧光染色、活性氧探针DCFH-DA、Rh123染色以及抗氧化酶活性检测试剂盒研究了心肌细胞氧化应激的发生及相关机制，结果表明模拟微重力效应24hr心肌线粒体分布发生改变，48hr细胞活性氧显著增加，线粒体膜电位改变，导致心肌处于氧化应激状态。同时心肌细胞抗氧化物酶活性增强、热休克蛋白和转录因子NF-κB高表达。抗氧化物SOD活性分析表明回转培养的氧化应激机制可能以超氧化物为主。此外，线粒体的氧化应激研究结果也提示氧化应激参与了心肌细胞模拟微重力效应的响应机制，而且与心肌细胞搏动变化及部分离子通道的变化具有一致性。 综上，本研究通过构造新型海藻酸钠微囊体，建立了适用于模拟微重力效应研究的细胞三维培养体系，同时通过系统的探讨心肌细胞对空间微重力环境的响应及其功能变化，证实模拟微重力效应会导致心肌细胞骨架改变，并引起线粒体分布发生变化，活性氧显著增加，线粒体膜电位改变，使心肌处于氧化应激状态。同时引起缝隙连接蛋白和离子通道蛋白的表达改变，最终导致原代心肌细胞搏动功能紊乱。
【关键词】：模拟微重力效应 海藻酸钠微囊体 细胞三维培养 细胞增殖 离子通道 氧化应激
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R85
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-41
• 1.1 课题研究背景和课题来源13-14
• 1.2 心脏电生理特征14-22
• 1.2.1 心肌细胞离子通道14-17
• 1.2.2 心肌电生理特性与离子流的关系17-20
• 1.2.3 心律失常的分子机制20-22
• 1.3 氧化应激对心脏功能影响22-23
• 1.4 微重力/模拟微重力效应对心脏结构和功能影响23-34
• 1.4.1 微重力/模拟微重力效应的生物学作用23-24
• 1.4.2 模拟微重力效应研究的心脏模型24-27
• 1.4.3 微重力对心脏功能及电生理的影响27-29
• 1.4.4 微重力影响心脏结构和功能的机制29-34
• 1.5 细胞三维培养34-38
• 1.5.1 细胞三维培养方法34-35
• 1.5.2 三维培养的优点35-37
• 1.5.3 心肌细胞三维培养37-38
• 1.6 本课题的研究意义和主要研究内容38-41
• 1.6.1 本课题的研究意义38-39
• 1.6.2 本课题的研究内容39-41
• 第2章 实验材料与方法41-57
• 2.1 实验材料41-45
• 2.1.1 细胞系及实验动物41
• 2.1.2 引物41-42
• 2.1.3 抗体42
• 2.1.4 常规试剂42-44
• 2.1.5 其它实验试剂44
• 2.1.6 实验仪器44-45
• 2.2 实验方法45-56
• 2.2.1 细胞培养45-47
• 2.2.2 鼠尾胶原的制备47
• 2.2.3 水凝胶力学分析47
• 2.2.4 液相色谱仪检测乳酸含量47
• 2.2.5 细胞面积测量方法47
• 2.2.6 细胞增殖分析47-48
• 2.2.7 线粒体氧化应激分析48-50
• 2.2.8 细胞凋亡检测50-51
• 2.2.9 免疫荧光标记技术51-52
• 2.2.10 心肌组织获取和固定52
• 2.2.11 免疫杂交技术检测蛋白表达52-53
• 2.2.12 实时定量PCR技术检测离子通道基因的表达53-54
• 2.2.13 大鼠尾悬吊模拟微重力效应方法54
• 2.2.14 大鼠心电图采集方法54
• 2.2.15 电子显微镜观察细胞超微结构54-55
• 2.2.16 统计学分析55-56
• 2.3 本章小结56-57
• 第3章 三维培养体系的建立57-73
• 3.1 引言57
• 3.2 三维培养系统载体材料的选择57-59
• 3.3 细胞-海藻酸钠微囊体培养体系的构建59-61
• 3.4 心肌细胞在海藻酸钠微囊体内生长状态分析61-71
• 3.4.1 海藻酸钠微囊体内心肌细胞H9c2 生长及代谢研究62-64
• 3.4.2 海藻酸钠微囊体用于原代心肌细胞培养64-71
• 3.5 讨论71-72
• 3.6 本章小结72-73
• 第4章 模拟微重力效应影响心肌细胞结构及增殖73-89
• 4.1 引言73
• 4.2 海藻酸钠微囊体包覆细胞模拟微重力效应实验体系的研究73-77
• 4.2.1 海藻酸钠微囊体包覆细胞RCCS回转转数研究73-74
• 4.2.2 RCCS回转培养中心肌细胞微丝结构分析74
• 4.2.3 海藻酸钠三维培养细胞回转培养的细胞生长特性74-77
• 4.3 模拟微重力效应对心肌细胞骨架结构影响77-81
• 4.4 模拟微重力效应对心肌细胞增殖的影响81-85
• 4.4.1 模拟微重力效应抑制三维培养的心肌细胞的增殖81-83
• 4.4.2 模拟微重力效应导致心肌细胞凋亡83-85
• 4.5 讨论85-87
• 4.6 本章小结87-89
• 第5章 模拟微重力效应对心肌细胞搏动功能影响及分子机制研究89-110
• 5.1 引言89
• 5.2 模拟微重力效应导致心肌细胞搏动改变89-90
• 5.3 模拟微重力效应对缝隙连接蛋白表达影响90-94
• 5.4 模拟微重力效应对钠通道蛋白和L-钙通道蛋白表达影响94-100
• 5.4.1 模拟微重力效应对钠通道蛋白表达的影响95-97
• 5.4.2 模拟微重力效应对L-钙通道蛋白表达的影响97-100
• 5.5 模拟微重力效应对钠钾泵和钠氢交换体表达影响100-107
• 5.5.1 模拟微重力效应对钠钾泵表达的影响100-104
• 5.5.2 模拟微重力效应对钠氢交换体表达的影响104-107
• 5.6 讨论107-109
• 5.7 本章小结109-110
• 第6章 模拟微重力效应对心肌细胞线粒体氧化应激的研究110-123
• 6.1 引言110
• 6.2 模拟微重力效应改变心肌细胞线粒体的分布110-112
• 6.3 模拟微重力效应致心肌细胞线粒体的响应机制112-116
• 6.3.1 模拟微重力效应对心肌细胞活性氧的影响112-114
• 6.3.2 模拟微重力效应对心肌细胞线粒体膜电位的影响114-116
• 6.4 模拟微重力效应致线粒体氧化应激的调控机制116-119
• 6.5 讨论119-121
• 6.6 本章小结121-123
• 结论123-125
• 参考文献125-146
• 附录Ⅰ146-147
• 附录Ⅱ147-150
• 附录Ⅲ150-151
• 附录Ⅳ151-158
• 附录Ⅴ158-159
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果159-162
• 致谢162-163
• 个人简历163

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：1040812