荧光法和分子对接研究4种黄酮与血清白蛋白的相互作用

发布时间：2016-11-06 19:23

  本文关键词：荧光法和分子对接研究4种黄酮与血清白蛋白的相互作用，由笔耕文化传播整理发布。

第38卷2010年4月

DOI：10.3724/SP.J.1096.2010.00483

分析化学（FENXIHUAXUE）研究报告第4期483～487

ChineseJournalofAnalyticalChemistry

荧光法和分子对接研究4种黄酮与血清白蛋白的相互作用

徐倩

邓丹丹

曹志娟

谢琼

梁建英

卢建忠

*

（复旦大学药学院，上海201203）

摘

要

结合分子对接理论和荧光法研究4种黄酮类天然产物与白蛋白的相互作用及作用机理。用FlexX

软件研究了黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、灯盏乙素和白蛋白的分子对接，然后用荧光法研究这4种黄酮类天然产物与牛血清白蛋白的结合反应，测定了结合常数KA、结合位点n等参数。研究表明：4种天然产物与牛血清白蛋白结合位点n≈1，温度对结合位点影响不大；黄芩素和汉黄芩素主要通过疏水作用力与白蛋白结合，而黄芩苷和灯盏乙素主要通过氢键和范德华力与白蛋白结合。荧光实验和分子对接理论研究结果一致，两者相互补充，能够从实验和理论两方面协同研究天然产物与蛋白之间的相互作用。关键词

牛血清白蛋白；黄芩素；黄芩苷；汉黄芩素；灯盏乙素；荧光光谱法；分子对接

1引言

蛋白质是药物发挥药效的重要载体和靶分子，探讨具有药理活性的天然产物与蛋白质的相互作用及作用机理，对于了解药物发挥药效的作用机制，揭示药物药效的实质内涵具有重要意义。血清白蛋白是一种重要的蛋白质，能与许多内源和外源性化合物结合，起到存储与转运作用。血清白蛋白有内源性

［1］

荧光，近年来常用于研究与药物的相互作用。杨曼曼等用荧光法研究喹诺酮类药物与白蛋白的作用；杨冉等

用荧光法研究黄酮与溶菌酶的相互作用；毕淑云等用荧光法研究抗生素与人血清白蛋

［4］［5］

白的结合反应；Wang等用荧光法研究橙皮苷类黄酮与牛血清白蛋白的相互作用；王敬政等用荧光

［6］

［2］

［3］

法研究中药活性成分芦荟大黄素与血清白蛋白的相互作用机制；薛永来等

子与肿瘤抑制蛋白的相互作用。

采用荧光法研究了金属离

黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和灯盏乙素是常见的黄酮类天然产物，具有广泛的药理活性。深入研究这些黄酮类天然产物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，对于阐述它们在体内的运输、分布和代谢等药aideddrugdesign，CADD）是建立在理作用机理具有重要的意义。计算机辅助药物分子设计（Computer-化学、生物学、数学、物理学和计算机科学基础上的综合学科，在药物研发中起到日益重要的作用。分子

主要用于研究蛋白质受体和药物小分子之间通过几何匹配和能对接技术作为一种重要的CADD手段，

量匹配从而相互识别的过程。其研究领域常涉及柔性受体处理、溶剂效应、互变异构体平衡转换、构造

评价函数等新问题。与其它计算机辅助药物分子设计方法相比，分子对接技术从整体上考虑配体和受能较好地避免局部作用较好、整体结合欠佳的情况，可为分子结合模式以及药物分子结体的结合效果，

［7］

构改造提供重要信息。本研究采用FlexX软件研究了黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和灯盏乙素与HSA之间的分子对接，以荧光光谱法研究这些天然产物与BSA的结合反应，并测定了结合常数、结合位点数与结合力类型，探讨了黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、灯盏乙素与白蛋白的作用机理。综合而言，荧光实验和分子对接理论研究结果一致，两者相互补充，能够协同从实验和理论两方面来研究天然产物与白蛋白之间的相互作用，对于研究药物在体内的运输、分布、代谢具有重要意义。

2

2.1

实验部分

仪器和试剂

PerkinElmerLS55荧光光度仪，实验中采用循环水浴维持样品温度。天然产物黄芩素、黄芩苷、汉

2009-09-26收稿；2009-11-12接受

本文系国家自然科学基金（No.90409017）和上海市中药现代化（No.08DZ1971201）资助项目*E-mail：jzlu@shmu.edu.cn

黄芩素、灯盏乙素（中国生物制品药品检定所）；牛血清白蛋白（BSA，上海爱紫特生物科技有限公司），所有溶液由去离子水配制。2.2

实验方法

HC1缓冲液（pH=7.4，以10mmol/LTris-含0.1mol/LNaCl以维持溶液离子强度）为溶剂，配制

1.5μmol/LBSA。配制0.6mmol/L天然产物标准溶液备用，其中黄芩素和汉黄芩素为乙醇溶液，而黄芩苷和灯盏乙素为DMF溶液。

取3mLBSA标准溶液于石英比色杯，用微量注射器逐次加入天然产物溶液进行荧光滴定（滴定累1，2，4，6，8，10和12μmol/L。每次滴定使天然产物在BSA溶液中的终浓度为0，加体积为60μL），结束后搅拌1min，稳定20min后，设定激发和发射荧光波长分别为280和340nm，激发和发射荧光狭缝宽度分别为5和2.5nm，分别测定上述样品在25与37℃时的荧光强度；并在同等条件下在BSA溶液中，加入60μL的乙醇和DMF作空白对照。

3

3.1

结果与讨论

黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、灯盏乙素与人血清白蛋白分子的对接研究

蛋白质数据库（PDB）中尚无牛血清白蛋白的结构信息，基于牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白

（HSA）的高序列同源性（76.52%），本实验选用HSA代替BSA，研究黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、灯盏乙素与人血清白蛋白分子的对接。采用FlexX对接软件研究天然产物分子与HSA的结合模式，Warfarin选取HSA与（R）-的复合物晶体结构为模板，受试天然产物与HSA的对接图见图1。

由图1可知，氢键是4个天然产物与HSA的一种重要作用方式。黄酮母核是黄酮分子的主要疏水基团，推测4种受试天然产物的黄酮母核，可能通过疏水作用力与HSA相互作用，而母核与HSA之间并无氢键作用。黄芩素结构中的氧原子与HIS242的H形成氢键；OH和6-OH的氧原子与ARG218黄芩苷的5-7位糖取代基中的两个羟基氧的H形成氢键，

原子分别与GLU（谷氨酸）中的H形成氢键，

一个羟基氢原子与LYS（赖氨酸）的O形成氢OH氧原子与GLU292的H键；汉黄芩素的5-7-OH的氧原子与LYS195的H形形成氢键，

成氢键；灯盏乙素的4位氧原子与LYS形成氢5-OH的氧原子与LYS形成氢键，6-OH的键，

7位糖取代基中氧原子与HIS242形成氢键，

的羟基氧原子与ARG222，ALA291，ILE290

形成氢键。

图1Fig.1

天然产物与HSA对接模型

MoleculardockingofnaturalproductsandHSA

Weblab软件显示配体-受体的相互作用模式，棍棒模型表示配体（天然产物），绿色线条表示与配体相互作用的氨基酸残基。黄色虚线表示蛋白复合物中的氢键相互作用。氮原子，氧原子分别用蓝色、红配体-色表示（TheinteractionmodewasdisplayedbyWeblabViewer.Thenatu-ralproductwasshownincyanstickandthecorrespondingactivesiteswereshowningreenline.Keyresiduesinthebindingpocketwerelabeled.Hydrogenbondinteractionsinligand-proteincomplexwereshowninyellowdashedline.Inthegraphsabove，itrogenatomsandoxygenatomsweremarkedblueandred，respectively）。

对接研究表明，黄芩苷和灯盏乙素与HSA之间形成较多氢键，而黄芩素与汉黄芩素之间的氢键数

目较少，推测是由于黄芩苷与灯盏乙素分子中有糖取代基，羟基较多，更容易形成氢键；而黄芩素与汉黄芩素分子中羟基相对较少，形成的氢键较少所致。氢键可能是黄芩苷和灯盏乙素与HSA之间的重要作用方式，而黄芩素和汉黄芩素则主要通过其它方式与HSA发生相互作用。

4种天然产物与HSA之间存在相互作用，总之，其中氢键是黄芩苷和灯盏乙素与HSA相互作用的

主要方式，氢键作用的强弱与天然产物分子中羟基数目密切相关。3.2黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、灯盏乙素对BSA荧光光谱的影响

BSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基，能发射较强的内源荧光，而天然产物加入BSA溶液中会与BSA发生相互作用，进而影响BSA的荧光。结果表明，在保持BSA浓度固定不变的情况

BSA的内源性荧光强度均呈现有规律的降低；但荧光光谱基本保持下，随着4种天然产物浓度的增加，不变，也没有任何一种天然产物引起荧光最大波长的明显改变。表明4种天然产物的确与BSA发生了

相互作用，进而猝灭了BSA的内源荧光，荧光实验结果与上述对接模型研究结果一致。3.3

荧光猝灭机理

荧光猝灭可由动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移引起。一般情况下，动态和静态猝灭可依据不同温度条件下的结果得以区别，对动态猝灭，温度的升高将增加分子间的有效碰撞和加剧电子转移过程，使荧光猝灭常数随温度的升高而增大。若是静态猝灭，则温度的升高将降低配合物的稳定性，使猝灭常数减小。在动态猝灭过程中，蛋白质等荧光体与荧光猝灭剂分子间的相互作用可以用动态猝灭常Volmer常数）来描述。数KSV（Stern-F0/F=1+Kqτ0［Q］=1+KSV［Q］

（1）

其中，F0是未加入BSA的天然产物溶液的荧光发射总量；F是加入天然产物后BSA溶液的荧光发射总［Q］量，是天然产物的总浓度；Kq是生物分子的猝灭常数，Kq=KSV/τ0，各类荧光猝灭剂对生物大分子

10

的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×10L/（mol·s）；τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，－8

生物大分子的平均寿命约为10s。

Q］以F0/F对［进行回归分析，计算在25和37℃下1～12μmol/L的受试天然产物引起的BSA荧

光猝灭常数KSV和Kq，数据见表1。

表1天然产物与BSA在25和37℃时的荧光猝灭常数KSV和Kq

Table1KSVandKqbetweenthenaturalproductandBSAat25and37℃

天然产物Naturalproduct黄芩素Baicalein黄芩苷Baicalin汉黄芩素Wogonin灯盏乙素Scutellarin

KSV1.91×1051.15×101.12×10

5

25℃Kq1.91×10131.15×101.12×10

13

r0.99270.99720.99790.9967

KSV1.19×1051.04×101.06×10

5

37℃Kq1.19×10131.04×101.06×10

13

r0.99830.99730.99170.9956

6.88×104

5

6.88×1012

13

6.31×104

5

6.31×1012

13

10

结果显示：在1～12μmol/L的浓度范围内，所有天然产物的Kq均远大于2.0×10L/（mol·s），表明动态碰撞猝灭不是引起BSA荧光猝灭的主要原因，观察25和37℃下天然产物的KSV发现，随着温

KSV减小，度升高，因此推断天然产物对BSA的荧光猝灭是由于天然产物与BSA形成复合物引起的静态猝灭。

受试天然产物与HSA的对接研究表明，天然产物被包裹在HSA中，通过氢键、疏水作用等方式与HSA结合形成复合物。本荧光实验得到的结论与对接模型研究结果一致。3.4

天然产物与BSA的结合常数KA和结合位点数n

静态荧光猝灭作用是指荧光体分子与荧光猝灭剂分子之间借助分子间作用力，彼此结合形成具有

而导致荧光体荧光强度减弱现象。天然产物分子与蛋白之间的相互作用一一定结构的超分子化合物，

般采用位点结合模型来描述。假设蛋白分子（P）对天然产物分子（Q）有n个等同且独立的结合部位，

Pt］，Qt］，（F0－F）/F］=lgKA+nlg［Qt］蛋白质总浓度为［天然产物总浓度为［用静态猝灭公式lg［处理（F0－F）/F］Qt］对lg［作图，计算天然产物与BSA在25和37℃下的结合常数KA和结合数据，以lg［

位点数n，数据见表2。天然产物与BSA的结合位点都接近1，，并且温度对结合位点影响不大，表明受试天然产物与BSA之间有稳定的结合力，天然产物可以被BSA储存和运输。3.5

天然产物与BSA作用力类型

天然产物等有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键作用力、范德

表2天然产物与BSA在25和37℃下的结合常数KA和结合位点数nTable2KAandnbetweenthenaturalproductandBSAat25and37℃

天然产物Naturalproduct黄芩素Baicalein黄芩苷Baicalin汉黄芩素Wogonin灯盏乙素Scutellarin

n1.21761.15021.15741.1141

25℃KA4.75×1065.99×103.82×10

5

r0.99800.99980.99890.9987

n1.44541.09611.14541.0694

37℃KA8.19×1072.94×102.14×10

5

r0.99930.99940.99850.9981

8.94×105

5

8.69×105

5

华力和静电引力等。不同有机小分子与蛋白质结合力的类型是不同的，从热力学观点看，在一定的温度和压力下，有机小分子与蛋白质的结合反应能否自发进行取决于体系的ΔG，ΔG<0有利于反应的自发进行。Ross等总结出了判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力

根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可以判断有机小分子与蛋白质之间的主学规律，

要作用力类型：ΔH>0，ΔS>0为疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0为氢键和范德华力；ΔH<0，ΔS>0为静电

引力。在温度变化不大时，ΔH可视为常数，由稳定常数可以求出反应的自由能变ΔG=－RTlnK，然后根据下式分别求出ΔH和ΔS：

ln（K2/K1）=［1/T1－1/T2］ΔH/R

ΔS=－（ΔG－ΔH）/T

（2）（3）

［8］

白蛋白结构很复杂，它和天然产物之间往往同时存在几种作用力。由前面所求得的KA值求得天然产物与BSA的热力学函数，结果见表3。

表3天然产物与BSA结合反应的热力学参数

Table3ΔG，ΔHandΔSbetweennaturalproductandBSAat25and37℃

天然产物Naturalproduct黄芩素Baicalein黄芩苷Baicalin汉黄芩素Wogonin灯盏乙素Scutellarin

ΔH（kJ/mol）182.16－45.52－1.80－36.90

ΔG（kJ/mol）25℃－38.09－32.96－33.95－31.84

37℃－46.96－32.45－35.25－31.64

25℃738.71－42.12107.85－16.95

ΔS（J/mol）

37℃738.73－42.12107.85－16.96

所有天然产物的ΔG<0，表明天然产物可以与BSA自发反应。根据ΔH和ΔS值判断，黄芩素通过疏水作用力与BSA结合；汉黄芩素的ΔH虽为负数，但接近零，推测主要也是通过疏水作用力与BSA结合；而黄芩苷和灯盏乙素主要通过氢键和范德华力与BSA结合。这与受试天然产物的结构密切相关，黄芩苷和灯盏乙素分子有较多取代羟基，因而较易与BSA形成氢键；而黄芩素和汉黄芩素的黄酮母核结构中取代羟基较少，更易与BSA发生疏水作用。

对接研究表明，黄芩苷和灯盏乙素与HSA之间形成较多氢键，而黄芩素与汉黄芩素氢键形成较少，荧光实验的结果与对接理论研究的结果保持一致。References

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YANGMan-Man（杨曼曼），XIXiao-Li（席小莉），YANGPin（杨频）.Chem.J.ChineseUniversities（高等学校化学学2006，27（4）：687～691报），

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徐倩等：荧光法和分子对接研究4种黄酮与血清白蛋白的相互作用

487

WANGZhen-Xing（王振兴），LIYan-Ni（李艳妮），SUNYan-Hua（孙艳华），QIAOJian-Jun（乔建军）.ActaChimicaSinica（化学学报），2007，65（17）：1881～1886

RossPD，SubramanianS.Biochem.，1981，20（11）：3096～3012

InteractionBetweenSerumAlbuminandFourFlavonesby

FluorescenceSpectroscopyandMolecularDocking

XUQian，DENGDan-Dan，CAOZhi-Juan，XIEQiong，LIANGJian-Ying，LUJian-Zhong*

（SchoolofPharmacy，FudanUniversity，Shanghai201203）

AbstractCombinedwithmoleculardockingmodel，afluorescencemethodwasappliedtoinvestigatethe

interactionbetweenBSAandfourflavonesandtheactingmechanism.TheinteractionbetweenBSAandfourflavones，includingbaicalein，baicalin，wogoninandscutellarinwasstudiedbytheFlexXmoleculardockingmodelandfluorescencespectroscopy.ThebindingconstantKAandthenumberofbindingsitenwerethusdetermined.TheresultsrevealedthatthebindingsitevaluebetweenflavonesandBSAwasnearlyoneandthebindingsitewastemperature-independent.ItwasfoundthatbaicaleinandwogonintendedtobindwithBSAmainlybyhydrophobicinteraction，whereasbaicalinandscutellarinreactedwithBSAmainlybyhydrogenbondandvanderwaalsforces.theexperimentalandtheoreticalview.Keywords

Bovineserumalbumin；Baicalein；Baicalin；Wogonin；Scutellarin；Fluorescencespectroscopy；

（Received26September2009；accepted12November2009）

Bothfluorescencespectroscopyandmoleculardockingmodelare

complimentarytoeachotherfortheinvestigationoftheinteractionbetweenalbuminandnaturalproductfrom

Moleculardocking

櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛櫛

中国化学会第27届学术年会（第一轮通知）

中国化学会第27届学术年会定于2010年6月20～23日在福建省厦门市举行。大会主题：创新型社会与化学的责6月19日报到。会议由中国化学会主办，任。会期4天，厦门大学承办，中国科学院福建物质结构研究所协办。

本次学术年会设立学术分会18个、专题论坛3个及专场展览展示。报告形式包括大会特邀报告、分会邀请报告、口头报告和墙报。欢迎广大化学工作者积极参加，踊跃投稿。

第9分会：分析化学征文范围：（1）色谱分离与分析；（2）传感器与芯片技术和应用；（3）分子光谱和原子光谱分析；（4）纳米技术在分析化学中的应用；（5）食品安全和环境化学；（6）化学计量学应用；（7）电分析化学；（8）波谱新技术与应用。

分会联系及论文收集人：江云宝地址：厦门大学化学院

电话：0592－2185662

电子信箱：ybjiang@xmu.edu.cn

邮政编码：361005

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本文编号：166721