芥子气及其砜类毒性代谢产物体内外转化机制研究

发布时间：2018-04-06 21:32

本文选题：衍生化　切入点：芥子气　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年硕士论文

【摘要】：芥子气(sulfur mustard,SM)是典型的双功能烷烃化试剂,也是难防难治的糜烂性化学战剂的代表,被称作毒剂之王‖。SM是日本遗弃在我国的化学武器的主要填充剂,对遗留地人民的安全以及环境造成了重大威胁,同时由于SM具有制备工艺简单,化学性质稳定,存储简便,防护困难和杀伤力大等特点,其仍然具有潜在的恐怖威胁,因此关于SM代谢途径及中毒机制的研究一直是国内外关注的热点。SM具有强烷基化活性,进入体内后会与体内的小分子及生物大分子的亲核性基团发生广泛的烷基化反应而导致某些生物功能受损。从化学反应的结果看,SM进入体内后主要经历水解、氧化、谷胱甘肽结合和β裂解,以及与DNA和蛋白质等大分子加合的代谢途径。目前关于SM代谢的研究报道集中在SM的水解产物硫二甘醇(TDG)及硫二甘醇亚砜(TDGO),β裂解产物(SBMSE)以及蛋白加合物,而关于SM在体内的氧化途径以及氧化产物的研究报道却较少。有文献报道SM的氧化产物芥子亚砜(SMO)芥子砜(SMO2)仍然具有烷基化功能,对机体有毒性损伤作用,SM在体内氧化代谢生成氧化产物会对机体造成进一步的毒性损伤,但一直缺少直接的数据证明SM在体内会发生氧化代谢过程。基于此,本课题组进行了关于SM体内代谢的研究,应用LC-MS/MS技术直接检测SM在血浆中的代谢产物,发现SMO是SM进入体内后血循环中的主要代谢产物,但由于SMO2活性较强,不适宜直接LC-MS/MS的直接检测,故SM进入体内后是否会继续氧化生成毒性氧化产物SMO2仍然缺少直接的数据支持。同时研究芥子气代谢产物发现,芥子气谷胱甘肽途径的代谢产物具有砜类氧化产物的特征结构,芥子气的氧化产物是否参与了芥子气的谷胱甘肽途径也需要进一步研究。本研究依托现代仪器分析技术和分析毒理学研究方法,以SM的氧化代谢过程为研究对象。通过分析SM,SMO和SMO2在体内的含量变化趋势,实现对SM的氧化代谢过程的监测,从而定量描述了SM的氧化代谢过程。同时本研究通过定向筛查的策略进一步研究了SM代谢的新途径。本研究的结果不仅为SM的代谢研究提供了新的检测技术,且进一步完善了SM的体内代谢过程,发现了氧化产物的可能毒性作用机制,和SM代谢的新途径。为了解决体内SM及其氧化产物难以同时检测的难点,本论文中利用SM及其氧化产物的烷基化活性,应用衍生化策略将三者转化为适用液相色谱质谱联用技术检测的稳定的衍生化产物,从而建立了生物基质中SM及其氧化产物同时检测的LC-MS/MS方法。并对包括衍生化试剂浓度、反应时间、反应温度、ph值等在内的衍生化条件进行了系统的优化使衍生化效率达到最佳。优化后的方法步骤简单方便操作,从样品采集到进样分析可在90min内完成。同时对所建立的方法进行了方法学考察,结果显示该方法在所考察的浓度范围内线性良好,定量限为0.2 1μg/l,绝对回收率在68%-92%,基质效应在75% 108%,准确度和精密度均满足生物样品分析检测的要求。本研究方法的建立为实际样品的检测以及sm氧化代谢过程的研究提供了方法基础。针对芥子气皮肤染毒大鼠模型,应用所建立的定量检测方法对芥子气在血中的氧化代谢行为进行了系统的研究。结果显示染毒后第一个采样点5min时血中可以同时检出芥子气,芥子亚砜和芥子砜,其中芥子气的检测时间窗为染毒后5min-6h,芥子气的氧化产物芥子亚砜及芥子砜的检测时间窗均为5min-9h,说明芥子气进入体内后会立即发生氧化代谢过程。sm皮肤染毒后血中smo2的量与sm相当,芥子气皮肤染毒后血中smo的峰值浓度(cmax)为3143.9±68.0μg/l,显著高于其他代谢产物,表明芥子气进入体内后smo是其主要的代谢产物,揭示了氧化途径是芥子气主要的代谢途径之一。为了进一步研究芥子气的氧化代谢过程,对芥子亚砜静脉染毒大鼠代谢动力学进行研究发现血中可以检出芥子砜,说明芥子亚砜可以继续氧化生成芥子砜,该研究结果完善了芥子气的体内氧化过程。通过研究芥子气染毒后芥子气及其氧化产物的代谢动力学行为发现芥子气氧化产物smo及smo2的达峰时间(smo:3.0±0.0h;smo2:2.6±0.5h)显著滞后于芥子气(0.5±0.09h),表明了芥子气在体内氧化代谢生成氧化产物的过程。同时发现芥子砜的平均驻留时间(mrt)为5.3±0.4h,显著长于sm及smo的mrt(sm:1.5±0.2h;smo:3.7±0.1h),且前期实验已发现体内高浓度的芥子亚砜会不断氧化生成芥子砜,结合芥子砜的毒性数据(ld50:50mg/kg),认为芥子砜在体内长时间的存在可能对机体造成进一步损伤。为了进一步研究芥子气的代谢新途径以及芥子气氧化产物对芥子气毒性作用的贡献,结合前人的工作以较稳定的二乙烯砜(dvs)作为芥子气氧化产物的代表,在细胞水平和整体动物水平来发现和确证芥子气氧化产物与谷胱甘肽的加合物。实验结果表明芥子气及芥子气氧化产物在体内均会生成谷胱甘肽加合物,根据加合物的结构特征推测体内sm的谷胱甘肽解毒途径不仅包括目前普遍认可的先结合再氧化途径,同时也存在被忽视了的先氧化成砜再与谷胱甘肽结合(并β裂解)的代谢过程。此结果表明芥子气的氧化产物也会参与芥子气的谷胱甘肽解毒途径,是芥子气谷胱甘肽途径的另一条通路。同时由于谷胱甘肽耗竭也是芥子气损伤的重要机制之一,故认为芥子气的氧化产物通过与谷胱甘肽加合而发挥毒性作用。本论文的创新点及新发现:1)通过衍生化策略首次建立了生物基质中SM及其氧化产物的定量检测新方法,该方法可以同时检测生物基质中的SM及其氧化产物,为SM的氧化代谢研究提供了有力的工具。2)通过SM染毒后血液中SM及其氧化产物的时效关系及代谢动力学研究,揭示了SM进入体内后的氧化代谢过程,同时发现单氧化产物SMO是SM中毒后血循环中的主要代谢产物,也是SM的重要生物标志物。并首次在血液中检出SM的毒性氧化产物芥子砜,为SM的代谢途径及损伤机制研究提供了新思路。3)通过分析芥子气及其氧化产物和谷胱甘肽的活性位点,同时结合β裂解产物的特征性结构,推测并在体内鉴定出SM谷胱甘肽加合物以及DVS谷胱甘肽加合物。并研究了芥子气氧化产物在体内的代谢行为,发现芥子气氧化产物通过谷胱甘肽结合发挥毒性作用并进一步代谢,同时完善了SM体内代谢的新途径。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R82

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