电喷雾质谱在医药领域应用进展

  本文关键词：电喷雾质谱在抗生素类药物中的分析研究，由笔耕文化传播整理发布。

　　摘 要 电喷雾提供相对简单的方法使非挥发性的溶剂形成气态，与此同时质谱技术提供更直接、灵敏度好的检测，使电喷雾质谱在天然药物化学中天然产物的提取、药物分析中生物体内的代谢、以及生物化学中具有生理活性的多肽和蛋白质检测等方面具有优势，电喷雾质谱可以检测低浓度，得到高准确性结果。本文就近年来电喷雾质谱在医药中的应用进行综述。
　　关键词 电喷雾 质谱 定性分析 药物代谢 蛋白质研究
　　近年来，随着医药的不断发展，天然药物化学中天然产物的提取产物，药物分析中生物体内的代谢研究，还有生物化学中具有生理活性的多肽和蛋白质，逐渐成为当前研究热点[1]；后基因组学的蛋白组学，在目前也显得相当活跃，而其中很多高极性、难挥发、热不稳定的大分子有机化合物出现，对其检测有难度。质谱作为一种分析检测手段已经出现几十年，电喷雾质谱（ESI-MS）也已发展十几年，成为一种通用质谱技术，它所涵盖的分析应用领域极其广泛，电喷雾质谱的出现解决不挥发和热不稳定等化合物的分析，应用于中、高极性的化合物，可以检测的分子质量范围从300～2000u的小分子化合物到分子质量超过15000u的生物大分子[2]，对于蛋白质、核酸等生物大分子在电喷雾质谱中容易形成多电荷峰，分子量测定准确度高，现今电喷雾质谱成为药学和生物医学研究领域重要的标志性工具，在定性肿瘤差异蛋白方面更是重要的工具，，拥有良好的前景。
　　1 电喷雾质谱特点
　　1.1 电喷雾质谱的发展
　　电喷雾和质谱成功地结合，是由Dole及其合作者在1968年发表论文中首次阐述；1984年Yamashita和Fenn发表的论文更清晰地阐述电喷雾电离机理，并认为可以用作液质联用（LC/MS）的接口；20世纪90年代，仪器制造和实际应用都表现出高速增长和全面发展的态势。1989年，报告ESI离子源与傅里叶变换离子回旋共振质谱联用成功范例；1991年，Sin，Boyle和Whitehouse报道电喷雾/飞行时间质谱，实现更高的准确度，更高的分辨率；随后离子阱电喷雾质谱、电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱仪（ESI-Q-TOF-MS）为代表的仪器在各行业应用开来。
　　1.2 电喷雾过程
　　将溶于极性、挥发性溶剂（如甲醇，乙腈，丙酮等）的样品溶液通过电喷针传输，在电场作用下形成泰勒锥，在电喷针尖部形成雾状正或负离子富集，液滴通过溶剂的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷密度不断增大；当电荷之间的排斥力克服表面张力时，液滴分裂，产生单个多电荷离子；生出的样品气相离子经质量分析器分析，从而测出它们的质荷比[3～6] 。
　　1.3 电喷雾电离的优势
　　电喷雾电离为一种软电离方式，即给样品较小的电离能量，可以得到不稳定化合物的分子离子峰，且谱图简单，主要用于定性分析。Loo等 [7]归纳出电喷雾质谱的4“S”特点：即灵敏（ Sensitivity）、快（Speed） 、专一（Specificity），并能直接给出化学计量比（stoichiomotry）。电喷雾质谱的成功在于2个重要的部分，电喷雾提供相对简单的方法使非挥发性的溶剂形成气态，与此同时质谱提供更直接、灵敏度好的检测[8]。电喷雾质谱可以检测阿摩尔级别浓度的样品[2]，并且ESI可在一级质谱（MS）条件下获得很强的待测物准分子离子峰，并且可借助MSn（n=2～10）对准分子离子进行多级裂解，进而获得更为丰富的结果信息[9]。ESI已成为一种成熟、高灵敏、快速的质谱技术。比较质谱的离子源（见表1），可以看出ESI的优势所在。
　　2 近期电喷雾质谱进展
　　近年来，电喷雾质谱已经不限于小分子的检测，伴随着蛋白组学、基因组学的发展，带动生物大分子分析的发展。蛋白等大分子化合物样品量少，不适合过于复杂的预处理过程，很多专家致力于提高该技术的离子化效率及减少样品预处理过程，能对复杂基体中的分析物进行简单、快速、实时分析。新发展出极低流速下的电喷雾质谱，被称为纳升电喷雾质谱（nanoESI/MS），电喷雾流速采用纳升级流速，流速低，产生的液滴体积小，稳定液流的流量越低，则电离效率几乎随之成比例地提高，对于蛋白样品量小的物质可以减少样品消耗量，又不会减弱信号强度，导致去溶剂化效率、离子化效率及离子转移至分析器的效率都比常规ESI源高，而且喷雾稳定性好[10]。对于电喷雾电离方式也发展出电喷雾解吸电离DESI、电喷雾萃取电离EESI 等，表2中按先后顺序总结电喷雾电离方式的发展。这些电离方式大多不经过样品预处理，可以进行实时、快速的质谱分析。
　　电喷雾的首要问题是样品的高纯度，因为一些不纯的物质易导致毛细管喷雾堵塞。近些年来，为避免ESI 堵塞，出现一些非毛细管喷射技术，这些技术利用不同的材料尖端形成电喷雾，如铜线及不锈钢针，用放电针为材料，直接离子化，避免毛细管堵塞现象，样品损失也减少，更适合微量样品的检测。最近，纸、牙签等尖端喷雾技术都成功地用于复杂混合样品的分析，使纸兼有导电和分离的作用，这项技术可以检测很多组织，对于医药中穿刺活检都可以进行检测，使得检测更方便、快捷[11]。
　　电喷雾质谱一般与液相质谱联用较多，进行分离鉴定，而一些新的液相色谱（ LC） 分离技术，例如超高效液相色谱（ UPLC） 和快速高分离液相色谱（ RRLC），研究新液相色谱和电喷雾质谱的连接，更好、更快地完成医药测定鉴定过程。郭小芳等[12]采用RRLC-ESI-MS方式在20min测定生物碱类成分，马长振等[13]用UPLC-ESI-MS测定白茅根的分析，仅在35min内完成鉴定工作。这些新出现的电喷雾质谱都为更好、更快、更高效地进行分离鉴定做出积极贡献。
　　3 电喷雾质谱在医药中的应用
　　3.1 定性分析药物及天然产物
　　电喷雾质谱可以进行多级质谱，电喷雾软电离方式，导致一级全扫描质谱中主要得到的是分子离子峰，这种分子离子峰能反映被测物组成的分子量信息；二级串联质谱（MS2）可直接对粗分离物中的已知成分进行快速鉴定，还可以对样品中具有相同生药来源的未知化合物进行结构预测。这为天然产物的物质组成分析提供一种简单、快速、灵敏的方法，简化繁琐的分离、纯化过程[14]。 　　天然产物是新药开发的重要部分，目前使用的很多药物都直接或间接来自天然产物。许国旺等[15]人采用傅里叶变换电喷雾质谱用于鉴定丙二酰基人参皂苷，加入甲酸铵流动相进行优化，选定浓度为15mM，谱图效果最好，电喷雾为负离子模式，丙二酰基人参皂苷的多级质谱具有特征的中性丢失信息，中性丢失44，根据此特点，可用于该类化合物的定性分析，而最终测定结果均通过准确质量验证，实验测定值与理论值偏差小于2ppm，提供准确、灵敏的方法。张道来等[16]人采用正离子模式，在60min内鉴定罗氏车盘车样品的13种化合物，还对刺身皂苷进行分析，实验证明高效液相色谱-电喷雾质谱法能克服皂苷类物质分子内由于寡糖链存在导致难鉴别的困难，对于皂苷类化合物的鉴别及结构分析中显示越来越重要的作用。李娟等[17]等对青蒿素类药物的质谱裂解特征进行分析，采用注射泵直接进样，正离子分析模式，对准离子峰进行碰撞诱导解离（CID） 研究，更好、更快地研究青蒿素的代谢以及结构分析。大黄类化合物也是天然产物，马小红等[18]采用正负离子全扫描，同样进行CID二级扫描，负离子扫描得到谱图更清晰，更好地做好特征分析。胡杨等[19]等发现采用负离子模式，川穹质谱响应度高，进而对川穹进行化学成分分析。吴茱萸也是传统中药，高鹏等[20]采用正负离子模式分别研究裂解方式，并发现负离子的响应更高、定量更好，对今后半萜吲哚类生物碱的鉴定检测提供一定实验基础。李丽等[21]利用电喷雾质谱分析鉴定防风中的未知成分，采用正离子模式。
　　而对于抗生素，廖琼峰等[22]人研究庆大霉素采用电喷雾正离子模式，对其碎片峰进行分析，二级离子打碎，打碎脱去C环（氨基葡萄糖）碎片，说明C环与脱氧链霉胺之间的碳-氧键容易断裂，可更好地用于今后庆大霉素定性和定量分析。抗生素在食品中的应用近年来也大受关注，采用UPLC/MS/MS，乙腈、七氟丁酸水溶液作为流动相，采用正离子电喷雾模式，多反应离子监测（MRM），仅需时3min，精确度、准确度良好。方东升[23]利用电喷雾质谱为软电离方式，在全扫描一级质谱图上主要得到的是分子离子峰，通过分析直接得到化合物的分子量，从而推测出金霉素样品中的杂质成分，快速地对金霉素进行监控。朱侃等[24]采用质谱等一系列方式测定头孢克洛的结构，采用正离子模式得到头孢克洛的特征峰和纯度。霍佳丽等[25]采用ESI-Q-TOF-MS青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素及喹诺酮类药物进行稳定性研究。显示出快速稳定、所需样品少等优点，为今后电喷雾质谱在抗生素方面的应用做一定基础研究。
　　电喷雾质谱在中药配伍方面也有很重要的影响，越皓等[26]人研究附子不同配伍药对生物碱的影响和附子中双酯型生物碱毒性，研究配伍减毒使其更好地发挥药效作用，通过分析生附子水煎液的电喷雾质谱图，可以看出生附子中主要的3类生物碱（双酯型、单酯型和脂类生物碱），以及其他小分子的化合物，然后分别和各种药材配伍测定验证，乌头碱类生物碱在电喷雾条件下形成的离子峰相对强度与其物质的量成正比例关系，电喷雾质谱图中各离子的相对丰度可以说明对应离子的相对含量变化，来看清双酯型是否减少，是否有配伍无毒性。甘遂甘草配伍[27]研究水煎液中巨大戟二萜醇型化合物在质谱中离子强度的变化，对萜醇类能更好地检测。中药黄芪与当归配伍采用正离子模式一级扫描，得到特征峰后进行二级串联质谱分析，碰撞能量20%～40%，查看异丙酮类的成分变化，质谱谱图清晰、准确、灵敏度高[28]。闫静等[29]根据生物碱类化合物具有较强质子亲和势的特点，利用电喷雾质谱在电喷雾电离条件下极易形成质子化分子，进行马钱子与甘草的配伍测定，测定出有毒的成分降低。综上，利用电喷雾质谱技术可以很好地说明中药的配伍原则。
　　3.2 现代药物代谢和药物动力学
　　ESI电离特别温和，成为分析不稳定共轭代谢物的适合方法，确定药物在体内的代谢，以评估药物的安全性、有效性。ESI电离技术效率高，可以获得更低的检测下限，可以用于范围更大的结构类型。Karthick Vishwanathan
　　等[30]人运用电喷雾质谱测定人血浆中的莫西沙星，运用洛美沙星做内标，定量限为1ng/mL，能更好地检测出代谢产物，定量采用正离子模式，因为存在氨基和酮基，很容易质子化，而且检测时间短，仅用4min，时间短，灵敏度高。李秋莎等[31]应用LC-MS/MS法研究茶多酚在大鼠体内的多组分药动学，运用负离子模式，特异性很高，分析样品仅需4min，大大缩短分析时间，LLOQ能达到5ng/mL，检测灵敏度得以提高。
　　万益群等[32]对人体尿液中黄蝶呤与异黄蝶呤进行测定，蝶呤类化合物采用电喷雾质谱起到双重定性的作用，通过选择离子来进行定量，能提高灵敏度，2种蝶呤正离子信号较负离子信号相对强的多，经实验证明，黄蝶呤与异黄蝶呤在ESI+模式中全扫描质谱以离子峰[M+H]+稳定存在，采用健康人和癌症的尿液，分别进行定量分析，方法快捷、准确。
　　ESI离子源能电离80%～90% 的化合物，属于通用型离子源，适用于多组分筛选[33]。沈保华等[34]用电喷雾质谱对血液及尿液中精神药品及其代谢物的筛选及确证，采用正离子电喷雾，测定56种化合物绝大部分最低检测限小于0.1ng/mL，建立包含精神药品及其代谢物共61种化合物的精确相对分子质量数据库分析方法，Jun Qian等测定紫杉醇在人血浆中的药代动力学，0.3mL血浆，定量下限为1ng/mL。
　　马海英等[35]检测粪中黄山药总皂苷及其代谢产物。整体给予大鼠灌服黄山药总皂苷于给药后不同时间，采集尿及血清样品，用ESI- MS检测吸收入血成分，测定时选择负离子方式检测，先用全扫描一级质谱方式获得待测物的准分子离子峰[M- H]–，离子源温度为120℃，然后用ESI- MSn离子阱技术对准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级质谱分析，获得相应的子离子质谱图。 　　高博彦等[36]测定复方酸枣仁汤的血浆代谢情况，在负离子模式下，仅进样10μL，在60min内，梯度洗脱，5%～90%乙腈溶液，检测到各色谱峰在负离子模式下的分子离子峰[M-H]–、[M+Cl]–，由分子峰测定可能的分子量，推断一定的结果，对比原有成分和人血吸收成分，有些许不同，含皂苷类的物质如酸枣仁，一般以原型或者苷元形式存在，一些含挥发油的物质入血较少。
　　周丽君等[37]测定注射用艾普拉唑钠用丁螺环酮作为内标，用比格犬做实验，最低浓度可以达到5μg/L，且在5min内出峰，采用电喷雾质谱简单快捷，特异性好，进行血药浓度的测定，与剂量呈线性。
　　陈永婧等[38]利用高分辨电喷雾四级杆飞行时间质谱，正离子扫描模式对膀胱癌血清和尿液代谢组学进行研究，对潜在的标志物进行筛选、鉴定，对代谢产物进行分析，对于电喷雾质谱而言非常快捷、方便。杨杰等[39]研究小柴胡汤对抑郁的影响，收集尿液，收集血液，正负离子同时扫描，看是否能应用于现在流行的抑郁疾病。
　　3.3 蛋白质方法
　　电喷雾特点在于可产生大分子化合物（肽，蛋白质）的多电荷离子，根据不同电荷数离子的质荷比可准确计算大分子化合物的分子质量和分析复杂生物介质中的样品，跟传统的质谱相比，扩大检测的Mr 范围，提高灵敏度，根据马安德等研究多肽的相对分子量问题，用电喷雾质谱测定蛋白质和多肤的相对分子质量，精确度可达到0.10%～0.01%。远比精度只有大约5%的聚丙烯酞膝凝胶电泳、凝胶过滤、蔗糖密度离心法等经典的蛋白质相对分子质量测定技术更快捷、更精确[40]。它还可与高效液相色谱（HPLC） 和高效毛细管电泳（CE） 等高效的分离方法相连接，结合2种系统分离和高灵敏、高准确度的优点，扩大质谱在生物领域的应用[7]。
　　电喷雾质谱对于鉴定凝胶电泳所分离的蛋白质提供有力的分析手段，通常途径是采用双向电泳的方式，分离出的斑点用胰蛋白酶酶解、提取，再用ESI-MS进行测定。孙明忠等[41]采用双向胶内差异凝胶电泳检测2，4-二硝基苯磺酸刺激人角质形成细胞HaCaT反应情况，选取的胶条做质谱分析，胶条的等电点、分子量和质谱分析的等电点、分子量基本吻合，进而继续对肽段进行研究。曾嵘等[42]结合双向电泳，测定胶内人肝癌细胞的蛋白组学，覆盖率达到72.5%，通过正常的肝细胞和肝癌细胞进行比对。牟芝蓉等检测维甲酸诱导肿瘤细胞分化有关蛋白质，用毛细管液相色谱和纳升电喷雾源串联的质谱。所有测定均在正离子方式下进行，经检测质量准确度小于0.1。何晓光[43]采用电喷雾质谱，正离子喷雾模式，筛选鉴定卵巢癌细胞乳源调节肽，为肿瘤等一系列因素提供治疗手段和依据。郭晔等[44]也用凝胶电泳和电喷雾质谱的方法对儿童急性淋巴细胞白血病的差异细胞蛋白进行分析测定。而对于N端封闭，测序仪不能很好地测序蛋白，电喷雾质谱可以结合软件更好地完成测序工作。现在更多采用免疫共沉淀方法（CO-IP）结合ESI-MS查看蛋白质之间的相互作用。电喷雾质谱允许在混合蛋白中蛋白质和蛋白质之间的反应，如乳清蛋白[45]，用电喷雾质谱结合有关生化技术可以进行氨基酸序列分析、蛋白质翻译后修饰的结构推断等。孙伟等[46]对牛血清蛋白和马细胞色素C进行优化实验，采用5%～30%的乙腈洗脱梯度，使得胰酶酶切多肽更好地鉴定出来；进行重复性实验时，主要洗脱峰的保留时间差别不超过1min，表明重复性良好；并研究丰度抑制与高丰度蛋白分子量之间的关系，验证高丰度蛋白导致丰度抑制多，结合质谱数据依赖的鉴定技术，导致高丰度的蛋白重复，低丰度可能检测不到，检测结果冗余蛋白较多。
　　在应用质谱做蛋白组学实验、鉴定肽实验的时候，离子带电荷数受实验条件影响，比如说，仪器所使用的电压，还有溶液的浓度和流速等等。明显的是，ESI过程中肽的性质会很大程度地影响电荷数，比如说氨基酸数目和种类还有肽的形成等，ESI中肽电荷数量可以扩大质谱仪的检测极限[47]。
　　4 展望
　　医药生物领域迅速发展，电喷雾质谱的应用会更加发挥它相应作用。如何保证样品损失量少和分析速度快、分析量多是发展方向。为推断化学合成药物杂质结构提供有效依据；为现有药物含量测定提供标准；对药物代谢研究痕量成分提供准确定量要求；对于更复杂成分的中药提供检测手段，解决一定的分析难点；对基因重组蛋白及蛋白组的研究等，在这些方面，电喷雾质谱有重要理论和实际应用意义[48]。
　　目前电喷雾质谱的应用还存在一些问题，譬如对于大分子样品消耗较大，分析时间长，蛋白重复性不好，小分子低丰度蛋白经常漏检等。如何更快、更好地[49]建立高通量的药物筛选方法、寻找以致病蛋白为靶点的药物前体分子提供新的手段[50]、建立药物毒性安全方案等等，以便更好地服务医药行业是今后需要提升的方面。
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  本文关键词：电喷雾质谱在抗生素类药物中的分析研究，由笔耕文化传播整理发布。